Was ist Chiralität?
Die Bindungen eines Kohlenstoffatoms (C) sind vom Winkel her angeordnet wie ein W4 Würfel beim Pen & Paper Rollenspiel.
In der Mitte des Würfels sitzt das C-Atom. An den Spitzen des Würfel sind die verschiedenen gebundenen anderen Atome.
Je nach wie viele verschiedene andere Atome am C-Atom hängen, ist dieses Konstrukt nicht drehsymmetrisch, so dass Varianten entstehen, die auf atomarer Ebene spiegelbildlich zueinander sind und sich biologisch unterschiedlich verhalten.
Manchmal wird auch die Händigkeit als Beispiel genommen, statt des Spiegelbildes. Chirale Moleküle verhalten sich wie rechte und linke Hand.
Beispiele für sich unterschiedlich verhaltende chirale Moleküle in der Biologie sind rechts- oder links Drehende Milchsäuren oder Zuckermoleküle, die es in D- und L-Form gibt.
Dieses Wissen ist Chemie Oberstufenwissen. Das ist gymnasialer Schulstoff. Im Unterricht machte ich damals Übungen, wo das chirale C in Molekülen mit einem * gekennzeichnet werden musste.
Die unterschiedlichen chiralen Varianten eines Moleküls können sich biologisch unterschiedlich verhalten.
In der Industrie nimmt man bei Syntheseprozessen, die chirale Moleküle als Resultat hat, wenn möglich, Enzyme, um die Ausbeute bestimmter Orientierungen zu erhöhen und den Ausschuss zu verringern.
Das Problem ist spätestens seit dem Contergan-Skandal bekannt. Danke für den Hinweis an Dr. Manfred Hauptreif. Thalidomide (Contergan) ist ein chirales Molekül.
Nur eines der Enantiomere des Thalidomide verursacht die bekannten Fehlbildungen bei Embryo und ist somit fruchtschädigend (teratogen).4
Das Problem ist an und für sich in der Pharma bekannt6 und wird auch zur Medikamentenentwicklung ausgenutzt:
“Die Umwidmung von Arzneimitteln für neue medizinische Anwendungen und Chiralitätswechsel sind Elemente von Sekundärarzneimitteln. Die Strategien der Umwidmung von Arzneimitteln und des Chiralitätswechsels wurden in der Arzneimittelforschung bisher meist unabhängig voneinander angewendet. Die Umwidmung von Arzneimitteln hat bei der Suche nach therapeutischen Behandlungen für die Coronavirus-Pandemie 2019 ihren Höhepunkt erreicht, während Chiralitätswechsel bisher übersehen wurden. Der vorliegende Artikel stellt die kombinierte Strategie der Umwidmung von Arzneimitteln und der chiralen Umwandlung vor und gibt einen Überblick über repräsentative Fälle von chiralen Arzneimitteln, bei denen diese Kombination angewendet wurde: Ketamin, Flurbiprofen, Fenfluramin und Milnacipran. Die deuterium-basierten chiralen Schalter von racemischen Thalidomid-Analoga, eine Variante der kombinierten Strategie aus Umwidmung und chiraler Umwandlung, werden ebenfalls behandelt. ”7
Chiralität und die unterschiedlichen Wirkweise von Enantiomeren sind also in der Pharma gut belegt und gehören zum täglichen Geschäft. Da kann sich keiner rausreden.
Das ionisierbare Lipid ALC-0315 ist chiral
Es gibt noch eine Sache, neben diversen anderen Einzelheiten10, welche die Hersteller den Zulassungsbehörden verschwiegen haben.
Schauen wir uns die Struktur von ALC-0315 genauer an:
Die Strukturen sind in dieser Abbildung leider nur 2D, man kann derartige Moleküle auch in 2D 3D darstellen, worauf man immer verzichtet hat, und zwar aus gutem Grund.
Selbst mir ist 4 Jahre nicht aufgefallen, dass ALC-0315 ein chirales Molekül ist, dabei hatte ich Chemie LK und musste im zweiten Semester Organische Chemie besuchen.
Chandra Kanta De et al12 haben sich das Chiralitätsproblem von ALC-0315 genauer angesehen.
“Stereoisomere von ALC315. ALC315 hat zwei identische stereogene Zentren und liegt daher als drei verschiedene Stereoisomere vor: (R,R)-ALC315, (S,S)-ALC315 und (meso)-ALC315.”
Diese Isomere können separiert hergestellt werden:
“Asymmetrische chemische Synthese der drei Stereoisomere von ALC315.”
Die Frage ist, haben das die Zulieferer Merck, Evonick, Acuitas und Croda = Avanti beachtet?13
Oder haben die Zulieferer alle unterschiedliche Isomerengemische, zusätzlich zu den chemischen Verunreinigungen14 geliefert?
Welches der drei verschiedenen Isomere verwendet wird, hat nämlich durchaus einen Effekt auf die Zellen:
“Transfektion des GFP-Expressionsplasmids in humane embryonale Nierenzellen 293T mit LNPs aus stereochemisch reinen ALC315-Isomeren. a, HEK293T-Zellen wurden 16 Stunden lang mit (S,S)-, (meso)- und (R,R)-ALC315-LNPs behandelt, und die GFP-Expressionen wurden mittels FACS gemessen und auf der horizontalen Achse angegeben. Die vertikale Achse gibt die Seitwärtsstreuung (SSC) für die Zellgröße an. b, Die Zellviabilität wurde durch die Aufnahme von Propidiumiodid (PI) angegeben, wie in der vertikalen Leiste dargestellt. Die horizontale Achse zeigt die Seitwärtsstreuung (SSC) für die Zellgröße an. Die Pfeile zeigen nicht lebensfähige Zellcluster an, die PI aufgenommen haben. c, Zellviabilität der HEK293T-Zelllinie. d, GFP-Expressionen der HEK293T-Zelllinie.”
SS leuchtet am meisten, tötet also am wenigsten Zellen und bringt das beste Ergebnis.
“Abbildung 4. Zellviabilität der KMG4-Zelllinie, die mit LNPs aus Stereoisomeren von ALC315 behandelt wurde: (S,S), (meso) und (R,R). a, Zellviabilität der KMG4-Zelllinie bei einer Konzentration von 0,05 mg/ml. b, Zellviabilität der KMG4-Zelllinie bei einer Konzentration von 0,10 mg/ml.”
Der Zellteppich bei SS ist am dichtesten, es ist also am wenigsten toxisch.
“Tatsächlich wurden für verschiedene Isomere von ALC315 unterschiedliche Zellviabilitäten festgestellt. Beispielsweise zeigte die Zytotoxizität von ALC315-Isomeren auf der KMG4-Zelllinie bei einer Konzentration von 0,05 mg/ml LNP, dass das (S,S)-Isomer praktisch keine Wirkung auf die Zellviabilität hatte und das (meso)-Isomer mit einer Zellviabilität von 97,7 % leicht toxisch war, während das (R,R)-Isomer eine deutlich geringere Zellviabilität (84,4 %) aufwies.”
“Abbildung 5. Expression von Entzündungsgenen in Jurkat-Zellen, die mit (S,S)-, (meso)- und (R,R)-ALC315 behandelt wurden, mittels RT-PCR. Jurkat-Zellen wurden mit ALC-Isomeren in einer Konzentration von 0,10 mg/ml behandelt. a, Die Zellviabilität nach 48 Stunden wurde als oberes Balkendiagramm und Fotos dargestellt. b, Die mRNA-Expressionsniveaus von IL-6, (c) TNF-α und (d) IFN-γ-R1 wurden nach 4 und 22 Stunden analysiert.”
“Da das (R,R)-Isomer von ALC315 eine höhere Zelltoxizität aufwies als die entsprechenden (meso)- und (S,S)-Isomere, haben wir die Expressionsniveaus repräsentativer Entzündungsgene wie IL-6, TNF-α und INF-γ R1 in Jurkat-Zellen analysiert, die für Zytokine verantwortlich sind. Interessanterweise wurde festgestellt, dass nach 22-stündiger Inkubation mit 0,10 mg/ml LNPs die mRNA-Expressionsniveaus dieser Gene im Fall des (R,R)-Isomers tatsächlich höher waren als bei den beiden anderen Isomeren (Abbildung 5b).”
“Wir haben die Stereochemie von ALC315 als Möglichkeit identifiziert, LNP-Formulierungen für eine sicherere und effizientere Nukleinsäureabgabe zu verbessern. Unsere gemeinsamen synthetischen und biologischen Untersuchungen zeigen, dass von den drei Stereoisomeren das (S,S)-Enantiomer die geringste Zytotoxizität und damit die höchste mRNA-Transfer-Effizienz aufweist. Tatsächlich scheint die (R)-Stereochemie mit einer erhöhten Zytotoxizität verbunden zu sein, entsprechend dem Trend (S,S) < (meso) < (R,R) ALC315, wie in biologischen Doppelversuchen beobachtet wurde. Bislang gibt es keine Studien, die die biologischen Wirkungen von Lipid-Stereoisomeren systematisch untersucht haben, sodass keine endgültigen mechanistischen Schlussfolgerungen möglich sind. Da jedoch die Externalisierung von Phosphatidylserin ein wichtiger Regulator der Apoptose ist, könnten unterschiedliche Wechselwirkungen mit diesem Lipid zur Zellschädigung beitragen. Darüber hinaus deuten aktuelle Berichte darauf hin, dass Cystein-Stereoisomere in Lipidnanopartikeln die Zytotoxizität über die Aktivierung von Caspasen 24 oder durch stereoselektive Bindung an zelluläre Rezeptoren wie den LDL-Rezeptor modulieren können. Obwohl der Mechanismus hinter diesem Phänomen derzeit noch unklar ist und Gegenstand laufender Untersuchungen in unseren Labors ist, sollte die Empfehlung lauten, in zukünftigen Arzneimittelverabreichungen nur das sicherere und effizientere ionisierbare Lipid (S,S)-ALC315 zu verwenden. “
Hätten das nicht die Hersteller vorher prüfen sollen? Diese Versuche erscheinen mir nicht allzu aufwändig zu sein?
Haben die Hersteller das in ihren QM/QS Methodiken berücksichtigt?
Die Antwort lautet klar: NEIN
Offizielle Untersuchungen, die von der EMA abgenickt wurden, sind:
Sichtkontrolle, Infrarotspektroskopie und Sterilität.
Kann man Chiralität mit IR-Spektroskopie sehen? Ich weiß es leider nicht. Ich vermute aber, man sieht das Problem nicht. Prof Dyker hat mir das auch per EMail bestätigt. Man würde es aber im CD (circular dichroism) photometer sehen (von denen Pfizer definitiv eines hat, weil sie damit die RNA gemessen haben).
Nun stellt sich die Frage, was andere Forscher mittels HPLC beobachtet haben:
16 Hätte Chiralität Einfluss auf den HPLC-Lauf oder sind das Synthesebeiprodukte?
17 Was sieht man im Massenspektrometer an Verunreinigungen?
Theoretisch wäre es möglich, Enantiomere im MS zu sehen, was man natürlich sicherheitshalber NICHT gemacht hat, damit man nichts sieht, was man nicht sehen möchte.
”Enantiomere von Arzneimitteln können sehr unterschiedliche pharmakologische Eigenschaften aufweisen, sind jedoch in ihrer chemischen Zusammensetzung und strukturellen Konnektivität identisch. Daher stellt die Trennung von Enantiomeren eine große Herausforderung im Bereich der Trennungswissenschaft dar. Die Trennung von Enantiomeren erfordert die Wechselwirkung des Analyten mit einer chiralen Umgebung – in der massenspektrometrischen Analyse erfolgt dies üblicherweise durch eine Dreipunktwechselwirkung mit einem chiralen Selektor, der häufig während der Probenvorbereitung eingesetzt wird. In ausgewählten Fällen führt der durch nichtkovalente Komplexierung bedingte Strukturunterschied zu enantiomerspezifischen Strukturunterschieden, was die Messung mit einer strukturselektiven Analysetechnik wie der Ionenmobilitätsmassenspektrometrie (IM-MS) erleichtert.”18
Fazit
Zu den bekannten, nachgewiesenen Verunreinigungsproblemen des ionisierbaren Lipids ALC-0315 kommt nun noch eine sehr spezielle Art der Verunreinigung hinzu, die Einfluss auf die Toxizität der Chargen haben kann.
Sind die starken Schwankungen in den Nebenwirkungen vielleicht auch auf unterschiedliche Mischungen der (S,S) < (meso) < (R,R) ALC315 Ennantiomere zurückzuführen?
Laut Pof. Dyker per EMail “Wenn man keine chirale Information in die Synthese reintut, dann gibt es am Ende auch nur eine statistische Verteilung, in diesem Fall ist das Verhältnis vom meso zu den beiden Enantiomerenen 2:1:1. Dass beim Einpacken der mRNA vielleicht eines der Stereoisomere ein wenig bevorzugt wird, kann schon sein, weil die mRNA ja auch chiral ist.”
ALC-0315 ist im LNP innen flüssig19 bindet direkt an die modRNA20 21.
Wie kann man mit solch undefinierten Ausgangssubstanzen versuchen ein pharmazeutisches Produkt herzustellen, wenn nicht einmal die grundlegende Chemie untersucht wurde?
Chandra Kanta De et al sind bei ihrer Publikation clever rangegangen. Sie adressieren das Problem nicht direkt, die schlagen vor, wie man die LNPs biochemisch optimieren und sicherer machen kann. Im Klartext, aktuell hat die Sicherheit der Technologie Optimierungsbedarf. Eine sehr diplomatische Art zu sagen, ihr habt Mist gebaut und toxische Enantiomere verwendet.22
Wikipedia-Autoren. (2003, May 16). Chiralität (Chemie). https://de.wikipedia.org/wiki/Chiralit%C3%A4t_(Chemie)
Schneider, L. (2024, April 16). Die Bedeutung der Chiralität in der Organischen Chemie. das-wissen.de. https://das-wissen.de/bildung-und-lernen/die-bedeutung-der-chiralitaet-in-der-organischen-chemie
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Thalidomid: der Wirkstoff von Contergan und seine Folgen. (n.d.). /Active-substance-thalidomid-and-its-consequences. https://www.contergan-skandal.de/de-de/wirkstoff-thalidomid
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da bei der mir bekannten Entwicklung neuer Substanzen stets die Isomere getestet werden (Trennung macht's allerdings teuer) bin ich mir sicher, dass dies bewusst unterlassen wurde
Na, da muss ich auch mal wieder eine Antwort posten. Dieses Problem der Chiralität ist ja auch exakt das Problem von Contergan gewesen. Ein Enatiomer war harmlos, das andere teratogen! Contergan hat damals ein ganz neues „Schlachtfeld“, einen neuen Zweig der organischen Chemie in der Synthese eröffnet. Enantiomerenreine Synthese von chiralen Molekülen. Mist, das Problem hab ich beim ALC-0315 ebenfalls komplett übersehen und das war der Kernpunkt meiner Doktorarbeit, die enantiomerenreine Synthese von nicht natürlichen Aminosäuren. Sorry dafür!