BioNTechs Liste der potentiellen prozessbedingten Verunreinigungen

Irina Vlatokovic hatte wieder das Bedürfnis, zu beichten

Dieser Artikel ist ein Jubiläumsartikel.

Dieser Artikel ist mein Artikel Nr.

BioNTech hat wieder mal ein Review rausgehauen, das keiner bemerkt hat. Und wieder war Irina Vlatkovic beteiligt, diesmal als letzter Autor, also als Gruppenleiterin.

Es handelt sich um ein reines BioNTech Review, es ist also juristisch problemlos zitierfähig.

Lenk R, Kleindienst W, Szabó GT, Baiersdörfer M, Boros G, Keller JM, Mahiny AJ, Vlatkovic I. Understanding the impact of in vitro transcription byproducts and contaminants. Front Mol Biosci. 2024 Jul 10;11:1426129. doi: 10.3389/fmolb.2024.1426129. PMID: 39050733; PMCID: PMC11266732. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39050733/

Man bedenke beim lesen, dass dieser Übersichtsartikel erschien, als ein entsprechendes Produkt bereits 3 Jahre auf dem Markt war.

Irina hat schon mal ein Geständnis abgelegt:

Plagt sie ihr Gewissen?

Oder ist es einer der Fälle, wo sie es einem sagen müssen, und wenn man dann doch zustimmt, haben sie ihr Karma geschützt?

Ich fasse die “Highlights” des Übersichtsartikels zusammen und kommentiere, wenn ich es für nötig halte (um meiner schlechten Laune ein Ventil zu geben).

Originaltext im Code Block.

Deutsche Übersetzung kursiv in Anführungszeichen.

Meine Kommentare in normaler Schrift.

Abstract

“But depending on the IVT conditions and subsequent purification steps, diverse byproducts such as dsRNA, abortive RNAs and RNA:DNA hybrids might form. Unwanted byproducts, if not removed, could be formulated together with the full-length mRNA and cause an immune response in cells by activating host pattern recognition receptors. In this review, we summarize the potential types of IVT byproducts, their known biological activity, and how they can impact the efficacy and safety of mRNA therapeutics. In addition, we briefly overview non-nucleotide-based contaminants such as RNases, endotoxin and metal ions that, when present in the IVT reaction, can also influence the activity of mRNA-based drugs. We further discuss current approaches aimed at adjusting the IVT reaction conditions or improving mRNA purification to achieve optimal performance for medical applications.”                         

„Je nach den IVT-Bedingungen und den anschließenden Reinigungsschritten können jedoch verschiedene Nebenprodukte wie dsRNA, abortive RNAs und RNA:DNA-Hybride entstehen. Unerwünschte Nebenprodukte können, wenn sie nicht entfernt werden, zusammen mit der mRNA in voller Länge formuliert werden und durch Aktivierung von Mustererkennungsrezeptoren des Wirts eine Immunantwort in den Zellen auslösen. In dieser Übersicht fassen wir die potenziellen Arten von IVT-Nebenprodukten, ihre bekannte biologische Aktivität und ihre möglichen Auswirkungen auf die Wirksamkeit und Sicherheit von mRNA-Therapeutika zusammen. Darüber hinaus geben wir einen kurzen Überblick über nicht-nukleotidbasierte Verunreinigungen wie RNasen, Endotoxine und Metallionen, die, wenn sie in der IVT-Reaktion vorhanden sind, ebenfalls die Aktivität von mRNA-basierten Arzneimitteln beeinflussen können. Wir diskutieren außerdem aktuelle Ansätze zur Anpassung der IVT-Reaktionsbedingungen oder zur Verbesserung der mRNA-Reinigung, um eine optimale Leistung für medizinische Anwendungen zu erzielen.”

“Aktuelle Ansätze zur Anpassung der IVT-Reaktionsbedingungen oder zur Verbesserung der mRNA-Reinigung, um eine optimale Leistung für medizinische Anwendungen zu erzielen.” …

DAS klingt mir nicht danach, als wenn das Problem gelöst wäre bzw. 2021 schon gelöst war. Gibt man hier potentielle Verunreinigungen zu?

Einleitung

However, due to the properties and components of the IVT reaction, distinct nucleotide-based byproducts may be formed in addition to the full-length mRNA molecule templated by the DNA. Moreover, depending on the starting materials or equipment used at different stages of the production and purification processes, other types of process related, non-nucleotide-based contaminants may be introduced. Any of the product or process related contaminants that reach the formulated drug can potentially activate pattern recognition receptors (PRRs), causing a host immune response that may negatively impact mRNA-encoded protein expression.

“Aufgrund der Eigenschaften und Komponenten der IVT-Reaktion können jedoch neben dem vollständigen mRNA-Molekül, das durch die DNA als Matrize dient, auch verschiedene nukleotidbasierte Nebenprodukte entstehen. Darüber hinaus können je nach den Ausgangsmaterialien oder den in den verschiedenen Phasen des Herstellungs- und Reinigungsprozesses verwendeten Geräten andere Arten von prozessbedingten, nicht nukleotidbasierten Verunreinigungen auftreten. Jede der produkt- oder prozessbedingten Verunreinigungen, die in das formulierte Arzneimittel gelangen, kann potenziell Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) aktivieren und eine Immunantwort des Wirts auslösen, die sich negativ auf die mRNA-kodierte Proteinexpression auswirken kann.

Ich würde mir weniger Sorgen um die Proteinexpression machen als darüber, was das für Folgen für den Patienten hat. Der Blickwinkel der Autorin wird sehr klar: Es geht ihr nur um das Produkt. Die Folgen der Verunreinigungen für den behandelten Menschen sind nicht ihr Fokus. Der Mensch ist hier der Wirt, der das Protein produziert, welches der Hauptfokus der Autoren ist. Der Mensch ist nur ein Mittel zum Zweck zur Produktion des wertvollen Proteins.

Diese Mustererkennungsreaktionen sind z. Bsp. cGAS-STING und die Folge wären Thrombosen¹ oder vielleicht stark deregulierte biochemische Pathways².

Thus, several aspects of mRNA production are necessary to implement, and they are under continuous development: (1) optimizing the IVT reaction components and conditions; (2) purification procedures; and (3) stringent quality control using analytical methods that can detect and characterize byproducts and contaminants. Previous reviews and assessment reports have already discussed in detail the specific analytical methods and quality controls currently used for mRNA-based drug manufacturing (European Medicines Agency, 2021; Schoenmaker et al., 2021; Daniel et al., 2022; European Medicines Agency, 2022; BioPhorum Operations Group Ltd, 2023). In this review, we will highlight the various types of IVT reaction byproducts and contaminants as well as their mechanisms of action that may influence the quality and performance of mRNA-based therapeutics.

Daher müssen mehrere Aspekte der mRNA-Produktion berücksichtigt werden, die sich derzeit in der kontinuierlichen Entwicklung befinden:

(1) Optimierung der IVT-Reaktionskomponenten und -bedingungen;

(2) Reinigungsverfahren; und

(3) strenge Qualitätskontrolle unter Verwendung analytischer Methoden, mit denen Nebenprodukte und Verunreinigungen nachgewiesen und charakterisiert werden können.

In früheren Übersichtsarbeiten und Bewertungsberichten wurden die spezifischen analytischen Methoden und Qualitätskontrollen, die derzeit für die Herstellung von mRNA-basierten Arzneimitteln verwendet werden, bereits ausführlich diskutiert (Europäische Arzneimittelagentur, 2021; Schoenmaker et al., 2021; Daniel et al., 2022; Europäische Arzneimittelagentur, 2022; BioPhorum Operations Group Ltd, 2023). In dieser Übersicht werden wir die verschiedenen Arten von IVT-Reaktionsnebenprodukten und Verunreinigungen sowie deren Wirkmechanismen hervorheben, die die Qualität und Wirksamkeit von mRNA-basierten Therapeutika beeinflussen können.”

2024 ist man noch in kontinuierlicher Entwicklung. Das Problem war 2020 nicht gelöst und ist wohl immer noch nicht gelöst. Die EMA scheint das auch zu wissen. Die strenge Qualitätskontrolle dieser Produktklasse geht bei USP gerade in die dritte Runde eines Entwurfes… USP, die amerikanische Pharmakopeia definiert, welche Untersuchungen notwendig sind, um die Sauberkeit eines Produktes sicherzustellen.

Der dritte Entwurf, der 20 Seiten hat, kann hier heruntergeladen werden: https://www.uspnf.com/sites/default/files/usp_pdf/EN/USPNF/usp-nf-notices/mrna-vaccine-chapter.pdf

In vitro Transkriptionsreaktion

A synthetic mRNA is typically produced in a cell-free enzymatic IVT reaction consisting of a DNA template to guide the sequence, free nucleoside triphosphate (NTP) monomers, a DNA-dependent RNA polymerase that transcribes the mRNA directly from the template, and an optimized buffer

“Eine synthetische mRNA wird typischerweise in einer zellfreien enzymatischen IVT-Reaktion hergestellt, die aus einer DNA-Matrize zur Steuerung der Sequenz, freien Nukleosidtriphosphat (NTP)-Monomeren, einer DNA-abhängigen RNA-Polymerase, die die mRNA direkt von der Matrize transkribiert, und einem optimierten Puffer besteht.”

DIe COVID-Produkte wurden jedoch nicht nach diesem typischen Verfahren hergestellt…. bzw. nur in der Studie, nicht in der Massenproduktion.

Man betreibt in diesem Artikel also Augenwischerei oder redet über die Probleme in Kleinserien nicht über die Probleme der Massenproduktion in E. Coli.

Der Übersichtsartikel behandelt also die Probleme des kontrollierten, sauberen Prozesses… und selbst da gibt es ungelöste Probleme.

IVT-Nebenprodukte und ihre biologischen Auswirkungen

The major forms of IVT byproducts are short or long ssRNA, dsRNA or RNA:DNA hybrids (Figure 1). Since many viruses rely on RNA to carry their genetic information, the uptake of such material has been determined through evolution to be a potential danger signal for the cell. The nucleotide-based byproducts are sensed by a multitude of immune pathways leading to inflammation, growth inhibition or even cell death (Figure 2) (Sahin et al., 2014; Devoldere et al., 2016; Vlatkovic, 2021). Even the purest single-stranded, uridine containing mRNA products show a certain degree of immunogenicity mediated through Toll-like receptor (TLR) 7 and 8 (Heil et al., 2004).

“Die wichtigsten Formen von IVT-Nebenprodukten sind kurze oder lange ssRNA, dsRNA oder RNA:DNA-Hybride (Abbildung 1). Da viele Viren RNA als Träger ihrer genetischen Information nutzen, hat sich die Aufnahme solcher Stoffe im Laufe der Evolution als potenzielles Gefahrensignal für die Zelle herausgestellt. Die nukleotidbasierten Nebenprodukte werden von einer Vielzahl von Immunwegen erkannt, die zu Entzündungen, Wachstumshemmung oder sogar zum Zelltod führen (Abbildung 2) (Sahin et al., 2014; Devoldere et al., 2016; Vlatkovic, 2021). Selbst die reinsten einzelsträngigen, Uridin enthaltenden mRNA-Produkte zeigen eine gewisse Immunogenität, die durch die Toll-like-Rezeptoren (TLR) 7 und 8 vermittelt wird (Heil et al., 2004).”

Und RNA:DNA-Hybride verhindern, dass die DNA-Vorlage verdaut wird, laut Kevin McKernan…

Hatte ich schon die diversen deregulierten Pathways erwähnt, nach mod-RNA-shot?³

Figure 1. In vitro transcription reaction input and output components and potential impurities. On the left side, linear DNA template (linearized plasmid and PCR product) and nucleoside-triphosphates (NTPs), including N1-Methylpseudouridine-5′-Triphosphate (m1Ψ), and RNA Polymerase (RNA Pol II) are listed as inputs to the IVT reaction. On the right side, outputs of the IVT reaction: mRNA (drug substance) and IVT byproducts are shown. In addition, potential impurities that can be introduced to the reaction through the raw materials or during the production process are listed in the middle.

Abbildung 1. In vitro Transkriptionsreaktionseingangs- und -ausgangskomponenten sowie potenzielle Verunreinigungen. Auf der linken Seite sind lineare DNA-Matrizen (linearisiertes Plasmid und PCR-Produkt) und Nukleosidtriphosphate (NTPs), einschließlich N1-Methylpseudouridin-5′-Triphosphat (m1Ψ) und RNA-Polymerase (RNA Pol II) als Eingaben für die IVT-Reaktion aufgeführt. Auf der rechten Seite sind die Ausgangsstoffe der IVT-Reaktion dargestellt: mRNA (Wirkstoff) und IVT-Nebenprodukte. Darüber hinaus sind in der Mitte potenzielle Verunreinigungen aufgeführt, die über die Rohstoffe oder während des Produktionsprozesses in die Reaktion gelangen können.

Figure 2. IVT reaction byproducts and contaminants and their impact in transfected cells. (A) Impact of IVT reaction byproducts and contaminants on innate immune activation is shown. Depicted are three receptor families, namely, Toll-like receptors (TLRs), retinoic acid inducible gene I-like receptors (RIG-I-like receptors) and NOD-like receptors (NLRs) known to detect ssRNA, dsRNA and RNA:DNA hybrids of various lengths. Activation of TLR4, 7, 8 or 9 leads via the MyD88-pathway and TLR3 via TRIF to the secretion of IFN- α/β and proinflammatory cytokines such as IL-6 or IFN-γ. Likewise, the RIG-I-like receptors, MDA5 and RIG-I lead via MAVS, TBK-1/IKK-ε and IRF-3 to a secretion of proinflammatory cytokines. In contrast, the NOD-like receptors NLRP1 and NLRP3 trigger inflammasome assembly and via caspase-1 lead to IL-1β and IL-18 release. Apart from the immunostimulatory activity of IVT byproducts of “nucleic nature”, detection of bacterial lipopolysaccharide (LPS) via TLR4 or caspase-4/5 and subsequent inflammasome activation triggers innate immune activation. (B) Mechanisms of translational inhibition due to effects of dsRNA byproducts are depicted. dsRNA can be recognized by protein kinase R (PKR) or 2′–5′ Oligoadenylate synthetases (OASes). Two PKR-molecules can autophosphorylate upon dsRNA binding, allowing phosphorylation of eIF2 transcription initiation factor. eIF2 plays a central role in initiating translation, thus, phosphorylation of eIF2 inhibits cap-dependent translation of RNA. OASes, on the other hand, act through linkage and oligomerization of ATP leading to activation of RNase L and, in turn, to the degradation of ssRNA (i.e., the drug product). Both PKR and OASes, as well as the RIG-I,-like receptors MDA5 and RIG-I participate in the formation of dsRNA-induced foci, so called stress granules which are thought to amplify or control dsRNA sensing responses.

“Abbildung 2. IVT-Reaktionsnebenprodukte und Verunreinigungen und deren Auswirkungen auf transfizierte Zellen. (A) Die Auswirkungen von IVT-Reaktionsnebenprodukten und Verunreinigungen auf die Aktivierung des angeborenen Immunsystems sind dargestellt. Dargestellt sind drei Rezeptorfamilien, nämlich Toll-like-Rezeptoren (TLRs), Retinsäure-induzierbare Gen-I-ähnliche Rezeptoren (RIG-I-ähnliche Rezeptoren) und NOD-ähnliche Rezeptoren (NLRs), von denen bekannt ist, dass sie ssRNA, dsRNA und RNA:DNA-Hybride unterschiedlicher Länge erkennen. Die Aktivierung von TLR4, 7, 8 oder 9 führt über den MyD88-Signalweg und TLR3 über TRIF zur Sekretion von IFN-α/β und proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6 oder IFN-γ. Ebenso führen die RIG-I-ähnlichen Rezeptoren MDA5 und RIG-I über MAVS, TBK-1/IKK-ε und IRF-3 zur Sekretion proinflammatorischer Zytokine. Im Gegensatz dazu lösen die NOD-ähnlichen Rezeptoren NLRP1 und NLRP3 die Bildung von Inflammasomen aus und führen über Caspase-1 zur Freisetzung von IL-1β und IL-18. Neben der immunstimulierenden Aktivität von IVT-Nebenprodukten „nuklearer Natur” löst der Nachweis von bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS) über TLR4 oder Caspase-4/5 und die anschließende Aktivierung von Inflammasomen die Aktivierung des angeborenen Immunsystems aus. (B) Mechanismen der Translationshemmung durch die Wirkung von dsRNA-Nebenprodukten sind dargestellt. dsRNA kann durch Proteinkinase R (PKR) oder 2'-5'-Oligoadenylatsynthetasen (OASes) erkannt werden. Zwei PKR-Moleküle können bei Bindung an dsRNA autophosphorylieren, wodurch die Phosphorylierung des Transkriptionsinitiationsfaktors eIF2 ermöglicht wird. eIF2 spielt eine zentrale Rolle bei der Initiierung der Translation, sodass die Phosphorylierung von eIF2 die cap-abhängige Translation von RNA hemmt. OASes hingegen wirken durch die Verknüpfung und Oligomerisierung von ATP, was zur Aktivierung von RNase L und damit zum Abbau von ssRNA (d. h. dem Arzneimittel) führt. Sowohl PKR und OASes als auch die RIG-I-ähnlichen Rezeptoren MDA5 und RIG-I sind an der Bildung von dsRNA-induzierten Foci beteiligt, den sogenannten Stressgranula, von denen angenommen wird, dass sie die dsRNA-Sensorik verstärken oder kontrollieren.”

Inflammasom klingt so harmlos, letzendlich verursacht das Inflammasom auch Thrombosen.

Welche Marker werden alle zum Nachweis von Post-Vac (PACVS) genommen?

⁴

Welche Pathways sind noch mal dereguliert nach mod-RNA-Shot?

⁵

Und das sind “nur” nicht produktionsbedingten Verunreinigungen, über die Irinas Gruppe da schreibt. Da sind die Lipide und das Spike-Protein noch gar nicht dabei.

Aber die Technologie ist sicher und zuverlässig.

Abgebrochene (zu kurze) Transkripte

Assuming abortive byproducts reach the cytosol of transfected cells, there might occur yet to be defined interactions with intrinsic RNAs or PRRs underlining the need for further research on IVT byproducts.

“Angenommen, abortive Nebenprodukte gelangen in das Zytosol transfizierter Zellen, könnten noch nicht definierte Wechselwirkungen mit intrinsischen RNAs oder PRRs auftreten, was weitere Untersuchungen zu IVT-Nebenprodukten erforderlich macht.”

Im Klartext, da sind unbekannte Unbekannte und das kann bös schiefgehen, aber wir haben dazu überhaupt keine Daten, daher sind unsere Produkte sicher und effektiv.

Doppelsträngige RNA (dsRNA)

Two main pathways for how dsRNA byproducts arise during IVT have been identified. One is by way of a promoter-independent, DNA-dependent transcription of the nontemplate strand (Mu et al., 2018) and the other is by RNA-dependent 3′ end additions (Cazenave and Uhlenbeck, 1994; Triana-Alonso et al., 1995). [...] Once inside a cell, dsRNA can be detected by several sensor proteins that lead to different response cascades. One class of well-known dsRNA sensors are the cytosolic RIG-I (retinoic acid inducible gene I)-like receptors (RLRs): RIG-I, melanoma differentiation-associated protein 5 (MDA5) and LGP2 (Rehwinkel and Gack, 2020) (Table 1; Figure 2A). While RIG-I and MDA5 are direct activators of pathways leading to the release of type I interferons, LGP2 is hypothesized to be a regulator of RIG-I and MDA5 (Satoh et al., 2010; Kato et al., 2011; Childs et al., 2013). RIG-I and MDA5 both activate the MAVS pathway upon filamentation and the subsequent ubiquitination and oligomerization of their two N-terminal CARD domains (Peisley et al., 2012; Peisley et al., 2013). MAVS recruits TRAF3/6 which subsequently activates the kinase complexes TBK1 and IKK, which in turn leads to activation of IRF3/7 and NF-κB, respectively (Wu et al., 2023). While the downstream signaling cascades of the two receptors are very similar, the dsRNA species that they each recognize are distinct. [...] Since most RNAs produced with IVT for clinical applications are longer than 500bp and can even be significantly longer, dsRNA byproducts of these RNAs would have the potential to trigger MDA5. RIG-I, on the other hand, is triggered by dsRNA species with a di- or triphosphate on the 5′end, and where the 2′-O position of the terminal nucleotide is unmethylated (Hornung et al., 2006; Schmidt et al., 2009; Goubau et al., 2014; Schuberth-Wagner et al., 2015).

“Es wurden zwei Hauptwege identifiziert, wie dsRNA-Nebenprodukte während der IVT entstehen. Der eine Weg ist eine Promotor-unabhängige, DNA-abhängige Transkription des Nicht-Matrizenstrangs (Mu et al., 2018), der andere Weg sind RNA-abhängige 3'-End-Additionen (Cazenave und Uhlenbeck, 1994; Triana-Alonso et al., 1995). [...]

Sobald dsRNA in eine Zelle gelangt ist, kann sie von mehreren Sensorproteinen erkannt werden, die unterschiedliche Reaktionskaskaden auslösen. Eine Klasse bekannter dsRNA-Sensoren sind die zytosolischen RIG-I (Retinsäure-induzierbares Gen I)-ähnlichen Rezeptoren (RLRs): RIG-I, Melanom-Differenzierungs-assoziiertes Protein 5 (MDA5) und LGP2 (Rehwinkel und Gack, 2020) (Tabelle 1; Abbildung 2A). Während RIG-I und MDA5 direkte Aktivatoren von Signalwegen sind, die zur Freisetzung von Typ-I-Interferonen führen, wird LGP2 als Regulator von RIG-I und MDA5 vermutet (Satoh et al., 2010; Kato et al., 2011; Childs et al., 2013). RIG-I und MDA5 aktivieren beide den MAVS-Signalweg nach Filamentierung und anschließender Ubiquitinierung und Oligomerisierung ihrer beiden N-terminalen CARD-Domänen (Peisley et al., 2012; Peisley et al., 2013). MAVS rekrutiert TRAF3/6, das anschließend die Kinase-Komplexe TBK1 und IKK aktiviert, was wiederum zur Aktivierung von IRF3/7 bzw. NF-κB führt (Wu et al., 2023). Während die nachgeschalteten Signalkaskaden der beiden Rezeptoren sehr ähnlich sind, unterscheiden sich die von ihnen jeweils erkannten dsRNA-Spezies. [...] Da die meisten mit IVT für klinische Anwendungen hergestellten RNAs länger als 500 bp sind und sogar deutlich länger sein können, könnten dsRNA-Nebenprodukte dieser RNAs MDA5 auslösen. RIG-I hingegen wird durch dsRNA-Spezies mit einem Di- oder Triphosphat am 5'-Ende ausgelöst, wobei die 2'-O-Position des terminalen Nukleotids unmethyliert ist (Hornung et al., 2006; Schmidt et al., 2009; Goubau et al., 2014; Schuberth-Wagner et al., 2015).”

Da bin ich biochemisch raus. Das kann ziemlich viel lostreten und unübersichtlich werden. Wenn man die potentiellen Reaktionen nicht mehr überblicken kann, sollte man vielleicht, aber nur ganz vielleicht, da NICHT REINPFUSCHEN.

Im Review werden noch mehr Proteine erwähnt, die dsRNA bemerken und Alarm schlagen. Wenn ich es aber schon unübersichtlich und unverständlich finde, brauche ich es hier wohl auch nicht mehr ausführen. Wen es interessiert, darf gerne im Original nachlesen.

RNA:DNA Hybride

During IVT the newly synthesized RNA strand can displace the nontemplate strand from the DNA duplex and anneal to the template strand of the DNA template, thus forming stable RNA:DNA hybrids. The amount of these hybrid byproducts depends on the sequence of the transcribed DNA template. IVT of purine-rich sequences or DNA templates containing multiple GAA repeats using T7 RNA polymerase has been demonstrated to yield significant amounts of RNA:DNA hybrids (Daniels and Lieber, 1995; Grabczyk et al., 2007).

“Während der IVT kann der neu synthetisierte RNA-Strang den Nicht-Matrizenstrang aus dem DNA-Doppelstrang verdrängen und sich an den Matrizenstrang der DNA-Matrize anlagern, wodurch stabile RNA:DNA-Hybride entstehen. Die Menge dieser hybriden Nebenprodukte hängt von der Sequenz der transkribierten DNA-Matrize ab. Es wurde gezeigt, dass die IVT von purinreichen Sequenzen oder DNA-Matrizen, die mehrere GAA-Wiederholungen enthalten, unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase zu erheblichen Mengen an RNA:DNA-Hybriden führt (Daniels und Lieber, 1995; Grabczyk et al., 2007).”

Trifft das auch auf die Sequenz der BioNTech Produkte wie BNT161B2 zu? Hat man das geprüft?

There is increasing evidence that the PRRs cGAS (Mankan et al., 2014), TLR9 (Rigby et al., 2014) and NLRP3 (Kailasan Vanaja et al., 2014) can detect RNA:DNA hybrids leading to the activation of innate immune signaling pathways and the induction of cytokine, chemokine and type I interferon expression. This strongly suggests that RNA:DNA hybrid contaminants are also sensed by innate immune receptors and thus, contribute to the immunogenicity of IVT mRNA. However, studies analyzing this possibility are currently lacking. Nevertheless, effective removal of contaminating RNA:DNA hybrids from clinical grade IVT mRNA should be considered if immune activation is not desirable in a therapeutic setting.

“Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass die PRRs cGAS (Mankan et al., 2014), TLR9 (Rigby et al., 2014) und NLRP3 (Kailasan Vanaja et al., 2014) RNA:DNA-Hybride erkennen können, was zur Aktivierung von Signalwegen des angeborenen Immunsystems und zur Induktion der Expression von Zytokinen, Chemokinen und Typ-I-Interferonen führt. Dies deutet stark darauf hin, dass RNA:DNA-Hybridkontaminanten auch von angeborenen Immunrezeptoren erkannt werden und somit zur Immunogenität von IVT-mRNA beitragen. Studien, die diese Möglichkeit untersuchen, fehlen jedoch derzeit. Dennoch sollte eine wirksame Entfernung von kontaminierenden RNA:DNA-Hybriden aus klinisch verwendeter IVT-mRNA in Betracht gezogen werden, wenn eine Immunaktivierung in einer therapeutischen Umgebung unerwünscht ist.”

Es gibt keine Daten, daher machen wir einfach weiter wie bisher, aber man kann ja darüber nachdenken, ob man die Hybride entfernt, oder halt nicht, wenn man nicht weiß wie.

Removal of the dsDNA template from IVT reaction mixes is usually achieved by digestion with DNase I directly after the completion of the IVT process. DNase I hydrolyzes ssDNA and dsDNA as well as the DNA strand of RNA:DNA hybrids. The specific activity of DNase I for RNA:DNA hybrids, however, is at least 100-fold below that for dsDNA (Sutton et al., 1997). Compared to the dsDNA template, DNase I therefore removes the RNA:DNA hybrid contaminants very inefficiently from IVT reactions. Residual RNA:DNA hybrids may thus be co-isolated together with the single-stranded mRNA from the IVT reaction mix by established methods like precipitation with lithium chloride or alcohol/sodium acetate, or by using nucleic acid binding silica material. In contrast to dsRNA, RNA:DNA hybrids are also not removed by cellulose-based chromatography (Baiersdörfer et al., 2019). Therefore, there is a need to establish methods for efficient elimination of RNA:DNA hybrids from IVT mRNA like HPLC (high-performance liquid chromatography) purification or optimized conditions for enzymatic digestion.

“Die Entfernung der dsDNA-Matrize aus IVT-Reaktionsgemischen erfolgt in der Regel durch Verdauung mit DNase I unmittelbar nach Abschluss des IVT-Prozesses. DNase I hydrolysiert ssDNA und dsDNA sowie den DNA-Strang von RNA:DNA-Hybriden. Die spezifische Aktivität von DNase I für RNA:DNA-Hybride ist jedoch mindestens 100-mal geringer als für dsDNA (Sutton et al., 1997). Im Vergleich zur dsDNA-Matrize entfernt DNase I daher die RNA:DNA-Hybridverunreinigungen sehr ineffizient aus IVT-Reaktionen. Restliche RNA:DNA-Hybride können daher zusammen mit der einzelsträngigen mRNA aus dem IVT-Reaktionsgemisch durch etablierte Methoden wie Präzipitation mit Lithiumchlorid oder Alkohol/Natriumacetat oder durch Verwendung von nukleinsäurebindendem Siliciumdioxidmaterial co-isoliert werden. Im Gegensatz zu dsRNA werden RNA:DNA-Hybride auch nicht durch Cellulose-basierte Chromatographie entfernt (Baiersdörfer et al., 2019). Daher besteht ein Bedarf an Methoden zur effizienten Entfernung von RNA:DNA-Hybriden aus IVT-mRNA, wie z. B. HPLC-Reinigung (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) oder optimierte Bedingungen für die enzymatische Verdauung.”

BioNTech gibt an dieser Stelle offen zu, dass sie die DNA, wegen der RNA:DNA-Hybride nicht weg bekommen… Das wissen wir mittlerweile auch von Kevin McKernan, aber es in ihren eigenen Worten zu lesen ist schon eine andere Sache.

Man gibt hier also offen zu, dass man die DNA nicht weg bekommt, was man vor Gericht aber bestreitet, obwohl es in den EMA Daten drinnen steht.

Und überhaupt, laut Gerichtsdokumenten ist DAS BISCHEN DNA total ungefährlich.

IVT-Reaktionsverunreinigungen/Verunreinigungen nicht-nukleotidischer Natur und ihre biologischen Auswirkungen

In addition to the intrinsic biochemical nucleotide-based byproducts produced during IVT, other types of exogenous contaminants or impurities that may be present in the final product could have a biological impact. Examples of these potential contaminants are residual solvents, enzymes such as RNases, endotoxins and metal ions. The source of these contaminants may be from the starting materials or the associated procedures such as template production, IVT reaction, purification, filtration, formulation, and packaging. Generally, GMP drug production relies on strict quality control of both the starting materials and the final drug substance. Special attention should be given to all possible extractables/leachables for all materials with liquid product contact. Since these contaminants, similar to nucleotide-based byproducts, may lead to significant biological effects, there is a necessity for strict mRNA production and quality assessments covering all types of potential contaminants and impurities not only for clinical studies but also for any research or preclinical studies.

“Zusätzlich zu den intrinsischen biochemischen Nebenprodukten auf Nukleotidbasis, die während der IVT entstehen, können auch andere Arten von exogenen Verunreinigungen oder Fremdstoffen im Endprodukt biologische Auswirkungen haben. Beispiele für solche potenziellen Verunreinigungen sind Lösungsmittelrückstände, Enzyme wie RNasen, Endotoxine und Metallionen. Diese Verunreinigungen können aus den Ausgangsstoffen oder den damit verbundenen Verfahren wie der Template-Herstellung, der IVT-Reaktion, der Reinigung, der Filtration, der Formulierung und der Verpackung stammen. Im Allgemeinen basiert die GMP-konforme Arzneimittelherstellung auf einer strengen Qualitätskontrolle sowohl der Ausgangsstoffe als auch des endgültigen Wirkstoffs. Besondere Aufmerksamkeit sollte allen möglichen extrahierbaren/auslaugbaren Stoffen für alle Materialien gewidmet werden, die mit flüssigen Produkten in Kontakt kommen. Da diese Verunreinigungen, ähnlich wie nukleotidbasierte Nebenprodukte, zu erheblichen biologischen Auswirkungen führen können, ist eine strenge mRNA-Produktion und Qualitätsbewertung erforderlich, die alle Arten potenzieller Verunreinigungen und Fremdstoffe abdeckt, nicht nur für klinische Studien, sondern auch für alle Forschungs- und vorklinischen Studien.”

GMP wurde für die COVID-Produkte ausgesetzt⁶ und nicht bestanden, das erwähnt Irina aber lieber nicht.

⁷

Welche Reinigungen schlägt Irina in ihrem Review vor?

Was hat man tatsächlich gemacht?
Diese Daten will die FDA, obwohl sie es eigentlich per Gerichtsbebeschluss müsste, bis heute nicht rausgerückt.

Ich glaube nicht, dass man BNT162B2 per HPLC gereinigt hat. Kann es aber ohne die FDA Daten nicht belegen.

Endotoxin

Endotoxin contamination of mRNA-based therapeutics might originate from linearized plasmids produced in E. coli used as templates for IVT reactions, or from any of the raw materials including water. Endotoxins originate from the outer membrane of Gram-negative bacteria. They are composed of lipopolysaccharide (LPS), consisting of an acylated backbone (lipid A) responsible for the induction of a proinflammatory immune response, a chain of repeated sugar units (O-antigen) and an oligosaccharide core (O'Neill et al., 2013; Cavaillon, 2018; Sondhi et al., 2024). If present, LPS contaminants can interact with LPS-binding protein (LBP), Myeloid differentiation protein 2 (MDA2), CD14 and Toll-Like Receptor 4 (TLR4), thereby leading to signal transduction through the TRIF and MyD88 pathways, resulting in the secretion of proinflammatory cytokines such as IL-6, TNF-α, and IL-1 (O'Neill et al., 2013; Sondhi et al., 2024). In addition, LPS can interact with caspase-4 in mice or caspase-4/5 in humans, leading to inflammasome activation and IL-1α and IL-1β release (Kayagaki et al., 2011; Viganò et al., 2015). Endotoxin is extremely potent, where even amounts as low as 0.1–0.5 ng/kg can lead to cytokine release, and dose-dependent side effects such as fever, chills, nausea, hypotension, tissue damage, sepsis, and death might occur (Elin et al., 1981; Sondhi et al., 2024). Thus, the upper limits and acceptance criteria as well as analytical methods for measuring endotoxin are strictly defined per USP chapter <85> Bacterial Endotoxins Test 3 (BET) based on dose, application route and type (Dawson, 2017). In addition to endotoxin, bioburden and sterility are part of the critical quality attributes (CQAs) ensuring the safety of mRNA products with regard to microbiological contamination (BioPhorum Operations Group Ltd, 2023).

“Die Endotoxinkontamination von mRNA-basierten Therapeutika kann von linearisierten Plasmiden stammen, die in E. coli als Templates für IVT-Reaktionen hergestellt wurden, oder von einem der Rohstoffe, einschließlich Wasser. Endotoxine stammen aus der äußeren Membran gramnegativer Bakterien. Sie bestehen aus Lipopolysaccharid (LPS), das aus einem acylierten Grundgerüst (Lipid A), das für die Auslösung einer proinflammatorischen Immunantwort verantwortlich ist, einer Kette aus sich wiederholenden Zuckereinheiten (O-Antigen) und einem Oligosaccharidkern besteht (O'Neill et al., 2013; Cavaillon, 2018; Sondhi et al., 2024). Wenn LPS-Verunreinigungen vorhanden sind, können sie mit LPS-bindendem Protein (LBP), Myeloid Differentiation Protein 2 (MDA2), CD14 und Toll-Like Receptor 4 (TLR4) und führen so zu einer Signalübertragung über die TRIF- und MyD88-Signalwege, was zur Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie IL-6, TNF-α und IL-1 führt (O'Neill et al., 2013; Sondhi et al., 2024). Darüber hinaus kann LPS mit Caspase-4 in Mäusen oder Caspase-4/5 in Menschen interagieren, was zur Aktivierung des Inflammasoms und zur Freisetzung von IL-1α und IL-1β führt (Kayagaki et al., 2011; Viganò et al., 2015). Endotoxin ist extrem wirksam, wobei bereits Mengen von 0,1–0,5 ng/kg zur Freisetzung von Zytokinen führen können und dosisabhängige Nebenwirkungen wie Fieber, Schüttelfrost, Übelkeit, Hypotonie, Gewebeschäden, Sepsis und Tod auftreten können (Elin et al., 1981; Sondhi et al., 2024). Daher sind die Obergrenzen und Akzeptanzkriterien sowie die Analysemethoden zur Messung von Endotoxinen gemäß USP-Kapitel <85> Bacterial Endotoxins Test 3 (BET) auf der Grundlage der Dosis, des Anwendungswegs und des Typs streng definiert (Dawson, 2017). Neben Endotoxinen gehören auch die Keimbelastung und Sterilität zu den kritischen Qualitätsmerkmalen (CQAs), die die Sicherheit von mRNA-Produkten hinsichtlich mikrobiologischer Kontamination gewährleisten (BioPhorum Operations Group Ltd, 2023).”

Und daher hat man den LAL-Test gemacht, mit dem man Endotoxine in LNPs nicht messen kann.

Daher sind auch alle Endotoxinmesswerte geschwärzt.

Das ist aber alles im Substack von GeoffPainPhD detailliert abgearbeitet.

Metallionen

The potential impact of metal ions on mRNA-based drugs is not fully understood. At high concentrations, heavy metal ions can bind with varying affinities to specific motifs in RNA. They can modify its secondary or tertiary structure and influence folding, potentially negatively affecting RNA stability (Pyle, 2002; Draper, 2004). [...]  Therefore, regarding undesirable metal ion contaminants, special attention should be given to potential leachables including containers, closures, storage bags, etc. (Table 2) early in process development as well as in the research laboratory for small scale mRNA production.

“Die potenziellen Auswirkungen von Metallionen auf mRNA-basierte Arzneimittel sind noch nicht vollständig geklärt. In hohen Konzentrationen können Schwermetallionen mit unterschiedlicher Affinität an bestimmte Motive in der RNA binden. Sie können deren Sekundär- oder Tertiärstruktur verändern und die Faltung beeinflussen, was sich möglicherweise negativ auf die RNA-Stabilität auswirkt (Pyle, 2002; Draper, 2004). [...] Daher sollte hinsichtlich unerwünschter Metallionenverunreinigungen frühzeitig in der Prozessentwicklung sowie im Forschungslabor für die mRNA-Produktion in kleinem Maßstab besonderes Augenmerk auf potenzielle Auslaugstoffe wie Behälter, Verschlüsse, Aufbewahrungsbeutel usw. (Tabelle 2) gelegt werden.”

Hat man das getan?

Wenn das so wichtig ist, warum hat man dann 55 undeklarierte Elemente (möglicherweise aus dem Verwendeten Wasser, oder aus Behältern, Verschlüssen und Aufbewahrungsbeuten) gefunden?⁸ Könnten diese potentielle Auswirkungen auf das Produkt haben?

Schlussfolgerungen und Zukunftsperspektiven

In vitro transcription (IVT) is the fundamental process used to generate synthetic mRNA transcripts at scale for therapeutics. All mRNA-based vaccines and drugs currently on the market or in clinical trials rely on the IVT reaction to be produced. 

“Die In-vitro-Transkription (IVT) ist das grundlegende Verfahren zur Herstellung synthetischer mRNA-Transkripte in großem Maßstab für therapeutische Zwecke. Alle mRNA-basierten Impfstoffe und Medikamente, die derzeit auf dem Markt sind oder sich in klinischen Studien befinden, basieren auf der IVT-Reaktion.”

Alle?

Nein!

Nicht BNT162B2

Warum lügt Irina an dieser Stelle? Oder kann es sein, dass nicht einmal die Mitarbeiter von BioNTech vom Verfahrenswechsel wissen?

Despite the advancements made to the IVT reaction, in the majority of cases it still produces byproducts and there are persistent challenges in scalability and mRNA purification.

“Trotz der Fortschritte bei der IVT-Reaktion entstehen in den meisten Fällen immer noch Nebenprodukte, und es bestehen weiterhin Herausforderungen hinsichtlich der Skalierbarkeit und der Reinigung der mRNA.”

Auch bei BNT162B2?

Würde Irina das vor Gericht beeiden?

For example, both the drug substance and byproducts can induce innate immune activation that might also impact adaptive immunity, and this may be beneficial for certain applications such as vaccines or fully undesirable for others such as RNA protein replacement therapies. These differences may necessitate specific manufacturing requirements for diverse medical applications.

“Beispielsweise können sowohl der Wirkstoff als auch Nebenprodukte eine Aktivierung des angeborenen Immunsystems auslösen, die sich auch auf die adaptive Immunität auswirken kann. Dies kann für bestimmte Anwendungen wie Impfstoffe von Vorteil sein, für andere wie RNA-Proteinersatztherapien jedoch völlig unerwünscht sein. Diese Unterschiede können spezifische Herstellungsanforderungen für verschiedene medizinische Anwendungen erforderlich machen.”

Liebe Irina, diese Produkte sind nur juristisch “Impfstoffe”. Biologisch sind sie Geninjektionen. Man sollte diese beiden Ebenen nicht vermischen. Oder wird hier gegendert? Als Impfstoff gelesene Geninjektionen?

In addition, complete characterization of certain byproducts and impurities depends strongly on sensitive and reliable analytical methods that are also constantly under development. 

“Darüber hinaus hängt die vollständige Charakterisierung bestimmter Nebenprodukte und Verunreinigungen stark von empfindlichen und zuverlässigen Analysemethoden ab, die ebenfalls ständig weiterentwickelt werden.”

Klingt nicht so, als wären diese Methoden 2020 schon verfügbar gewesen. Sind sie es heute?

Here we have discussed the biological impact of some byproducts, for example, dsRNA, which in high quantities leads to cytokine and chemokine release and thus potential safety issues. However, a better understanding of the types, subclasses and quantities of all byproducts and impurities as well as defining their biological impact in different cell types, including in diverse application routes would be highly beneficial for characterizing mRNA drug activity and safety. For example, it is still challenging to detect and quantify dsRNA byproducts smaller than 50bp and therefore difficult to understand their biological effects. Moreover, the biological impact of abortive RNA byproducts originating from the IVT reaction also remains elusive in the context of RNA therapeutics. Thus, further research of the biological effects of IVT reaction byproducts and impurities, together with improved analytical methods will help in future tailoring of mRNA drug production for specific medical applications.

“Hier haben wir die biologischen Auswirkungen einiger Nebenprodukte diskutiert, beispielsweise dsRNA, die in hohen Mengen zur Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen und damit zu potenziellen Sicherheitsproblemen führt. Ein besseres Verständnis der Arten, Unterklassen und Mengen aller Nebenprodukte und Verunreinigungen sowie die Definition ihrer biologischen Auswirkungen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich verschiedener Anwendungswege, wäre jedoch für die Charakterisierung der Wirksamkeit und Sicherheit von mRNA-Arzneimitteln von großem Nutzen. Beispielsweise ist es nach wie vor schwierig, dsRNA-Nebenprodukte kleiner als 50 bp nachzuweisen und zu quantifizieren, sodass ihre biologischen Wirkungen nur schwer zu verstehen sind. Darüber hinaus sind die biologischen Auswirkungen von abortiven RNA-Nebenprodukten, die aus der IVT-Reaktion stammen, im Zusammenhang mit RNA-Therapeutika ebenfalls noch unklar. Daher werden weitere Untersuchungen zu den biologischen Wirkungen von IVT-Reaktionsnebenprodukten und Verunreinigungen sowie verbesserte Analysemethoden dazu beitragen, die Herstellung von mRNA-Arzneimitteln für spezifische medizinische Anwendungen in Zukunft besser anzupassen.”

Wie hat man die dsRNA-Nebenprodukte kleiner als 50 bp in BNT162B2 nachgewiesen, wenn es 2024 noch schwierig war?

Wenn die Auswirkungen von zu kurzen RNA-Nebenprodukten noch unklar sind, wie kann BioNTech behaupten, es gäbe keine Impfschäden?

Ich erinnere in Sachen Sauberkeit der modRNA gerne an dieses Gel, welches schon HPLC gereinigt zu sein scheint. Es sollte nicht so nach unten wegschmieren.

und #humpgate. Erinnert sich noch jemand an #humpgate.

Sauber ist anders…

1.

2.

3.

4. Halma, Matthew et al. Breaking the silence: Recognizing post-vaccination syndrome Heliyon, Volume 11, Issue 11, e43478 https://www.cell.com/heliyon/fulltext/S2405-8440(25)01864-X

5. Hickey TE, Mudunuri U, Hempel HA, Kemp TJ, Roche NV, Talsania K, Sellers BA, Cherry JM, Pinto LA. Proteomic and serologic assessments of responses to mRNA-1273 and BNT162b2 vaccines in human recipient sera. Front Immunol. 2025 Jan 27;15:1502458. doi: 10.3389/fimmu.2024.1502458. PMID: 39931577; PMCID: PMC11808009. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC11808009/

6.

7.

8. At Least 55 Undeclared Chemical Elements Found in COVID-19 Vaccines from AstraZeneca, CanSino, Moderna, Pfizer, Sinopharm and Sputnik V, with Precise ICP-MS. (2024). International Journal of Vaccine Theory, Practice, and Research , 3(2), 1367-1393. https://doi.org/10.56098/mt1njj52