“Ich gestehe, ich habe in meiner Doktorarbeit gain-of-function- Experimente durchgeführt. Damals nannte man das noch gerichtete Evolution (directed Evolution). Mir war als Doktorand das dual-use Potential der Technologien, welche ich genutzt und selbst entwickelt habe, nicht bewusst. Was ich in meiner Doktorarbeit wirklich gemacht habe, wurde mir erst in den Corona-P(l)andemie klar. Als Doktorand empfand ich mein Thema als sinnlose geistige Selbstbefriedigung ohne Realitätsbezug, außer vielleicht, um Enzyme für Waschmittel oder chemische Prozesse zu optimieren. Da die dazu genutzten Methoden jedoch damals von Maxygen sehr weit abpatentiert waren, war ein Einsatz im Rahmen der industriellen Nutzung noch in weiter Ferne und nur im universitären Rahmen möglich. Eine karrieretechnische Sackgasse. Nie hätte ich gedacht, dass ich fast 20 Jahre später aktuelle Probleme mit Daten aus meiner Doktorarbeit vorhersagen und erklären könnte. Offensichtliche Probleme, welche von den Herstellern anscheinend komplett ignoriert wurden. Auch beim PCR-Test spielt erstaunlicherweise gene-shuffling eine Rolle, von dem bisher kaum ein Mensch jemals etwas gehört hat. Dieses Buch soll einen Einstieg bieten in die Probleme, die sich auf der Proteinebene ergeben, wenn man Proteine verändert und dabei die Regeln der Natur nicht versteht und ignoriert.”

Man kann es direkt beim Verlag bestellen, da verdienen Zwischenhändler wie amazon und CO nicht mit: https://www.hesper-verlag.de/home/117-grenzdebile-schwachsinnsideen-9783943413472.html

Oder auf den sonst üblichen Plattformen: https://www.amazon.de/Grenzdebile-Schwachsinnsideen-Satirische-Anklageschrift/dp/3943413470/

Ein paar Impressionen:

Mein persönlicher, kleiner Stryer Biochemie nur für das Spike-Protein.

Hier die Struktur des Spike Proteins (6xra1), bei welcher ich die drei Untereinheiten A, B, C in den Farben Rot, Grün, Gelb eingefärbt habe.

Das Programm, mit welchem man sich die *.pdb Dateien anschauen kann, heißt Swiss PDB Viewer.2 Beim Öffnen des Modells 6xra gibt es Warnmeldungen, dass einige Aminosäuren nicht aufgelöst sind und das Modell Lücken hat…

6xra habe ich gewählt, weil diese auch von Pfizer für die Modellierung genutzt wurde.

3

Menschen, welche die modRNA-Injektionen erhalten haben, produzieren über längere Zeit Spike-Proteine.4

Da ein einzelnes Spike-Protein rotationssymetrisch ist, ist es erst einmal egal, in welcher Reihenfolge die Untereinheiten verbaut wurden.

Wenn aber jemand 3 verschiedene “Impfungen” erhalten hat, bzw. zwei aktualisierte Booster zur Grundimmunisierung erhalten hat oder Varianten mit P-Lock oder ohne P-Lock (Astra), ergeben sich damit bereits 10 unterschiedliche mögliche Spike-Proteine.

Ein Trimeres Protein ist nicht ewig fix und stabil. Es kann seine (Tanz-)Partner tauschen wie in einem Jane Austen Regency dance. Das habe ich in meiner Promotion selbst beobachtet. Mein Protein bildete Trimere, Hexamere und Nonamere. Wenn ich den Hexamer-Peak separat noch einmal über eine Säule (Sephadex 200) laufen ließ, spaltete sich dieser wieder in drei Peaks auf.

5

Mittlerweile ist das auch anderweitig wissenschaftlich veröffentlich.

“In jüngerer Zeit hat die begrenzte Anwendung von In-vivo-Fluoreszenz und anderen Techniken gezeigt, dass viele Komplexe, die zuvor als stabil und in ihrer Zusammensetzung einheitlich galten, dynamisch variabel sind und kontinuierlich Komponenten mit einem frei zirkulierenden Pool von „Ersatzteilen” austauschen.”6

“Proteinkomplexe sind dynamische Makromoleküle, die sich ständig in freie Untereinheiten aufspalten und gleichzeitig wieder zu diesen zusammensetzen.”7

Gemessen hat man das z. Bsp. auch für Hitzeschockproteine.8

Nun ist es so, dass das Spike-Protein unsymmetrische Hexamere und Nonamere bildet. Novavax hat in seiner Science Publikation auch darauf verzichtet, die drei Untereinheiten unterschiedlich einzufärben, um auf den trimeren Charakter (nicht) hinzuweisen. Novavax hat des weiteren seine Strukturen auch nicht bei pdb.org hinterlegt, was ich als schlechten Stil empfinde. Strukturen hat man, nach Veröffentlichung, gefälligst auch in öffentlichen Datenbanken, zu hinterlegen.

9

Bei diesen nicht rotationssymetrischen Strukturen, ist die Reihenfolge, in welcher die drei unterschiedlichen Untereinheiten verbaut wurden, wichtig, weil jedes Mal eine andere Struktur entsteht.

Damit ergeben sich für ein Hexamer 729 mögliche Strukturen

und für ein Nonamer 19683 mögliche unterschiedliche Strukturen.

Auf jede exponierte Oberfläche dieser 10 - 19683 möglichen Strukturen können sich passende Antikörper bilden.

Es gibt natürlich Strukturen, die häufiger vorkommen werden als andere, abhängig von der jeweiligen Menge der unterschiedlichen Untereinheiten.

Hexamere und Nonamere werden seltener als Trimere sein, aber sie könnten vorkommen. Welche unterschiedlichen Antikörper sich bei Hybriden Spike-Proteinen, vor allem an Kontaktstellen mit Mutationen/Variationen bilden können, ist nicht untersucht und könnte einige der überraschenden Autoimmunreaktionen mit erklären und warum diese bei einigen Menschen auftreten bei anderen nicht.

Auch bei Shedding machen hybride Spikes teilweise unterschiedliche Symptome. Ich kenne einen Fall, der reagiert nur auf Menschen, die mit Johnson + BioNTech + Moderna mit einer Mastzellaktivierung ein weiterer Fall nur auf reine BioNTech Inokulierte.

Leider gibt es in den Zulassungsunterlagen der jeweiligen aktualisierten “Impfungen” keine Liste, welche Aminosäuren geändert wurden. Es gibt aber generelle Übersichten.

10

Stellen der Omicron Mutationen nach “Gelbe Liste” per Swiss PDB Viewer in Untereinheit A von 6xra markiert, soweit in der Struktur aufgelöst. Man sieht sehr schön, dass die Struktur auch in diesem (von BioNTech/Pfizer verwendeten Fall) lückenhaft ist.

Bei der FDA findet man diese Liste11

Und hier erneut ein Beispiel, warum man selbst denken soll und nicht auf die KI hören sollte. Dieser Effekt wird von Grok als potentieller Mechanismus zur VERBESSERUNG der Immunantwort beschrieben…

12

Obwohl, ausprobiert hat man das wirklich und erzeugte so eine stärkere Immunreaktion.13 14 Ob das wirklich besser ist, sei mal dahingestellt, da die Versuche davon ausgehen, dass die einmal gebildeten Trimere ihre Partner nicht mehr tauschen können. Zudem ignorieren alle diese Studien die Hexameren und Nonameren Strukturen.

Am 21. Januar 2020 erschien ein interessantes Paper mit dem Titel „Eine Perspektive auf molekularer Ebene zur Häufigkeit, Verteilung und den Folgen von Veränderungen der mRNA“

Jones JD, Monroe J, Koutmou KS. A molecular-level perspective on the frequency, distribution, and consequences of messenger RNA modifications. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2020 Jul;11(4):e1586. doi: 10.1002/wrna.1586. Epub 2020 Jan 21. PMID: 31960607; PMCID: PMC8243748. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31960607/

Dieses Paper hätten die modRNA-Gläubigen lesen können, bevor sie dieses System auf die Menschheit losgelassen haben, da hätten sie nämlich erkennen können, dass sich dar gerade eine vollkommen neue Richtung der Biologie entwickelt namens Epitranskiptomik, die gerade gezeugt wurde und nicht mal so wirklich in den Kinderschuhen steckt. Vielleicht wäre ihnen dann aufgefallen, dass diese modRNA-Plattform so gar keine gute Idee ist.

Ich werde in diesem Artikel das Paper in gekürzter, kommentierter Form auf die Highlights zusammenfassen, die dem interessierten Laien erkenntlich machen sollten, dass die modRNA-Plattform auch aus Epitraskriptomik-Sicht eine grenzdebile Schwachsinnsidee ist und das hätte man schon im Januar 2020 erkennen können/sollen.

Da ist ein Review, Herrgott, seichte wissenschaftliche Unterhaltungsliteratur, die man zur Entspannung liest. Das sollte man auch in einer Pandemie auf dem Klo hinbekommen. Das hat bei der Sumpfsuppe doch auch so super funktioniert.

Ich werde hierfür das Paper hauptsächlich übersetzen, kürzen und mit ein paar ironischen Kommentaren versehen, um die wichtigsten Stellen so zu überspitzen, dass selbst das dümmste Schaf in der Überspitzung zumindest die Grundlagen mitnehmen sollte.

Abstract

„Jüngste Fortschritte bei den genomweiten Sequenzierungstechnologien haben die Identifizierung von mRNA-Modifikationen als potenzielles neues Grenzgebiet der Genregulierung ermöglicht und zur Entwicklung des Epitranskriptom-Bereichs geführt. In der Folge wurden zahlreiche bahnbrechende Entdeckungen gemacht, darunter neue Modifikationen, nukleosemodifizierende Enzyme ("writers" und "erasers") und RNA-bindende Proteine, die chemische Modifikationen erkennen ("readers").“

Wir haben hier also schon im Abstract ein paar gute aber auch ein paar schlechte Nachrichten.

Die gute Nachricht zuerst: Es gibt die Hypothese, dass es Proteine gibt, die diese modRNA Modifikationen rückgängig machen können. Diese Proteine heißen „eraser“. Leider, leider handelt es sich dabei um eine Hypothese, denn bisher konnte noch keines dieser Eraser-Proteine für das in der Sumpfsuppe verwendete modifizierte Nucleodid (m1Ψ) identifiziert werden, aber immerhin für m6A, m1A un m5C: „Bis heute wurden keine "reader" oder "eraser" für andere mRNA-Modifikationen (als m6A, m1A und m5C) gemeldet, obwohl vorgeschlagen wurde, dass das Ribosom als universelles Lesegerät für Modifikationen in mRNA-kodierenden Regionen dienen kann“. ABER es muss sie wohl definitiv geben. Sooooooo weit ist man im Fachbereich der Epitranskriptomik, man hat zumindest schon einmal Hypothesen, die man nun bearbeiten kann.

Die schlechte Nachricht: „Diese Entdeckungen öffneten die Tür zum Verständnis, wie posttranskriptionale mRNA-Modifikationen den mRNA-Lebenszyklus modulieren können, und stellten eine Verbindung zwischen dem Epitranskriptom und menschlicher Gesundheit und Krankheit her.“

Die Tür zum Verständnis wurde geöffnet. Man hat also erkannt, oh FCK, das Epitranskiptom kann Ursache für Krankheit sein.

Was Du nicht sagst Sherlock.

Es wird aber noch besser und wir sind erst im Abstract:

„Obwohl ihre Bedeutung immer mehr erkannt wird, sind grundlegende Fragen zur Identität, Verbreitung und zu den funktionellen Folgen von mRNA-Modifikationen noch nicht geklärt.“

Und weil das alles noch komplett unbekannt und NICHT GEKLÄRT ist, haben Moderna und BioNTech/Pfizer einfach mal alles Uracile (U) gegen N1-Methylpseudouridin (m1Ψ) ausgetauscht, so um auf der sicheren Seite zu sein, schätze ich.

„Im Zuge des Fortschritts auf diesem Gebiet sehen wir die Notwendigkeit einer weiteren Integration von quantitativen und reduktionistischen Ansätzen zur Ergänzung von transkriptomweiten Studien, um einen Rahmen auf molekularer Ebene für das Verständnis der Auswirkungen chemischer Veränderungen der mRNA auf biologische Prozesse zu schaffen.“

Also, verstehe ich das richtig, man ist erst dabei dieses Fachgebiet überhaupt zu etablieren und Studienansätze zu entwickeln, damit man die Epitraskriptomik erforschen kann?!

Wie gut, dass man das nun in Milliarden von Menschen live beobachten kann, welchen Einfluss diese Modifikationen in mehrzelligen Euraryoten auf Gesundheit und Krankheit haben, da kann man direkt mit einem ordentlich großen Datensatz starten und kann auf die Tierversuche verzichten.

Der geneigte Leser, der zwischen den Zeilen lesen kann, erkennt sicherlich die Stimmung, in welcher ich mich beim Schreiben befinde. Gummizelle, damit ich den Kopf gegen die Wand rammen kann, ohne Schaden zu nehmen, wäre aktuell echt wünschenswert, Rauputz tut so weh.

Einleitung

„[…] mRNA-Modifikationen haben das Potenzial, die Proteinexpression zu steuern […]

Es ist noch unklar, ob die meisten Modifikationen auf Off-Target-Aktivitäten auf ncRNA-modifizierende Enzyme zurückzuführen sind, oder ob sie eine neue Ebene der posttranskriptionellen Kontrolle darstellen. Unabhängig davon haben mRNA-Modifikationen wahrscheinlich biologische Konsequenzen, da diese chemischen Markierungen die Interaktionen zwischen mRNAs und der zellulären Maschinerie beeinflussen können. Die Untersuchung von mRNA-Modifikationen ist ein schnell wachsendes Gebiet, da die Forscher versuchen, den Einfluss von mRNA-Modifikationen auf die Biologie und die menschliche Gesundheit zu ermitteln. […]

Um zu verstehen, wie der Status der mRNA-Modifikation zu einzelnen biologischen Prozessen und Krankheitszuständen beiträgt, müssen jedoch noch wichtige grundlegende Fragen zum Einbau und zu den Folgen der mRNA-Modifikation auf molekularer Ebene untersucht werden.“

Erst einmal ein wenig Begriffserklärung:

ncRNA = non coding RNA, also RNA, die nicht für Proteine kodiert, sondern teils auch regulatorische und andere Funktionen hat. Die Anzahl der ncRNA im Menschen ist unbekannt. Und von vielen der identifizierten ncRNAs kennt man ihre Funktion nicht. Einige kennt man aber wie tRNA (transfer RNA) oder rRNA (ribosomale RNA), daneben gibt es aber noch ein paar mehr, von denen ich bisher teilweise auch noch nie gehört habe: microRNAs, siRNAs, piRNAs, snoRNAs, snRNAs, exRNAs, scaRNAs und lange ncRNAs (Xist und HOTAIR (lustiger Name übrigens hot air = heiße Luft)). Muss man nicht im Detail verstehen, soll nur zeigen, da ist noch viel unbekannt, man weiß aber, da gibt es was und das scheint irgendwie wichtig zu sein, will man gesund bleiben.

Off-Target-Aktivitäten = Effekte wo anders als sie eigentlich stattfinden sollten. Also wenn z. Bsp. die Sumpfsuppe nicht im Muskel verbleibt und im ganzen Körper diversen Schabernack treibt.

Im Großen und Ganzen sagt die Einleitung, wir haben keine Ahnung von nichts. Nicht einmal ob es da noch Proteine gibt, die Einfluss auf die modRNA nehmen. Wie auch immer, das hat alles wahrscheinlich biologische Konsequenzen (wer hätte das gedacht?). Es sind nicht mal die grundlegenden Fragen zum Einbau der Modifikationen geklärt, ABER Ugur hat einfach mal alle U gegen m1Ψ ausgetauscht. Wer braucht schon die Klärung von grundlegenden Fragen oder auch nur ein grobes Verständnis über die Funktion dieser Modifikationen?! Ugur bestimmt nicht, denn Ugur ist ein Genie und weiß es natürlich besser.

Bei der nun folgenden Abbildung 2 im Paper fällt einem etwas unangenehm auf:

Da fehlt doch was?

Na, was fehlt?

m1Ψ fehlt.

Überhaupt glänzt m1Ψ in diesem Paper Großteils durch Abwesenheit, weil es dazu wohl so wenig Daten gibt, dass es nur in einem Nebensatz erwähnt wird.

Welches Nucleotid hat man genommen, daher sicherheitshalber genommen? Eines bei dem viele Daten vorliegen oder eines, das so wenig Daten hat, dass man es in einem Review zum Thema nur am Rande erwähnt?!

Einmal mit Profis arbeiten, sage ich da nur.

Gut, die Daten werden jetzt nun wohl im großangelegten Menschenversuch um Nachhinein erzeugt und werden noch viele Reviews füllen, schätze ich.

Ab dieser Stelle konzentriert sich der Autor hauptsächlich auf ein modifiziertes Nucleotid namens m6A, weil

„wir haben wir ein begrenztes (oder gar kein) Bild von der biologischen Rolle der anderen 14 gemeldeten mRNA-Modifikationen.“

Und wie erwähnt, m1Ψ zählt da nicht dazu, das ist nicht mal auf der Übersicht, so „viele“ Daten hat man dazu.

QUANTITATIVE ANSÄTZE ZUR UNTERSUCHUNG DER MRNA-VERÄNDERUNG: EBENEN UND FOLGEN

In diesem Teil der Publikation widmet sich der Autor den eigentlich noch nicht wirklich etablierten Nachweismethoden dieser RNA-Modifikationen.

Man kann Massenspektrometrie machen, nachdem man die modRNA zerlegt hat, und so quantifizieren, was und wieviel drinnen ist, ABER

„MS-Ansätze sind begrenzt, da sie keinen Sequenzkontext für modifizierte Nukleoside liefern und große Mengen hochgereinigter mRNA erfordern.“

Im Klartext: Man weiß, dass es drinnen ist, aber nicht wo und warum und das auch nur für m6A und nicht für m1Ψ. Da hat man nicht mal diese Methodik etabliert.

Ähm…. Wie genau haben Moderna und BioNTech dann bitte ihr Endprodukt charakterisiert, wenn man das noch gar nicht kann?

Ich frag nur für einen Freund.

„In ähnlicher Weise können die Halbwertszeiten aller zellulären mRNAs parallel gemessen werden, indem RNA-seq verwendet wird, um die zeitabhängige Verringerung der mRNA-Spiegel nach Abschaltung der Transkription durch kleine Moleküle wie Actinomycin oder temperatursensitive RNA-Polymerase-II-Mutanten zu beobachten Ribosomen-Profiling und transkriptomweite Halbwertszeitmessungen liefern aussagekräftige Informationen über die Details der mRNA-Stabilität und -Translation und haben unser Verständnis der RNA-Biologie erheblich verbessert.“

Wie genau haben Moderna und BioNTech/Pfizer die Halbwertszeit ihrer modRNA bestimmt und wie verlässlich sind diese Daten? Wenn man zugrunde legt, was in den Behandelten Menschen an Messwerten aktuell erhoben wird, scheinen mir die so erhobenen Daten zur Halbwertszeit der modRNA nicht sonderlich verlässlich zu sein.

In-vitro-Biochemie und Strukturbiologie

„Generell ist über die Strukturen von RNAs im Vergleich zu Proteinen viel weniger bekannt. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass Strukturen von RNA und RNA-Protein-Komplexen <5 % der in der Protein Data Bank (PDB) hinterlegten Strukturen ausmachen.“

Die schönen Bildchen, welche Strukturen von RNA miteinander interagieren und diese netten Muster bilden sind MODELLE!!! Nur so nebenbei. Keiner weiß, wie RNA wirklich aussieht, zumal diese MODELLE 2D sind und RNAs ein 3D Struktur haben.

Bei Proteinen würde das bedeuten, man weiß welche Aminosäuren verbaut sind und kann vorhersagen wo Helixes oder Faltblatt Strukturen sein müssten, wie diese sich im Raum anordnen weiß man nicht.

Man hat keinen Schimmer, wie sich die RNA Strukturen im 3D Raum anordnen. Noch weniger Ahnung, als bei Proteinen, weil es noch weniger Strukturen gibt. Aber selbst in der 2D Ebene fällt auf, dass da was gehörig schiefgelaufen ist. Da braucht man von 3D gar nicht erst anfangen[i].

Und da hat man reingepfuscht, ohne Sinn und Verstand.

„Der Vergleich von modifizierten und nicht modifizierten mRNAs kann zusätzliche Informationen darüber liefern, wie die Form von mRNAs durch Modifikationen beeinflusst wird.“

Verstehe ich das richtig? Das hat man bisher noch nicht gemacht?! Nicht einmal bei Moderna oder BioNTech/Pfizer? Wäre das nicht sinnvoll, um zu sehen, inwieweit sich modRNA vom viralen Original unterscheidet. DAS wäre ja noch OHNE „Codonoptimierung“, die käme noch hinzu, so ganz nebenbei.

„Strukturstudien werden sich nicht nur als nützlich erweisen, um zu verstehen, wie sich Modifikationen auf die intrinsischen Eigenschaften von mRNAs auswirken, um deren Funktion und Stabilität zu beeinflussen, […]“

Im Original steht da „will prove“, also eindeutig ein Futur. Also irgendwann in der Zukunft, werden wir vielleicht Strukturstudien haben, die zeigen, wie die jetzt schon in der Plörre verwendeten Modifikationen die Struktur, Funktion, Stabilität und ganz generell die Eigenschaften der modRNA im weitesten Sinne beeinflusst haben.

Das schafft doch Vertrauen in die gerade gestartete Impfkampagne mit den angepassten Plörren.

„Es ist davon auszugehen, dass Veränderungen in der mRNA-Struktur, der Ladung oder der Fähigkeit zur Basenpaarung die Interaktion dieser Moleküle mit anderen Biomolekülen verändern. Daher sind kinetische und thermodynamische In-vitro-Tests erforderlich, um festzustellen, wie Modifikationen die Wechselwirkungen zwischen mRNA und Proteinen, anderen RNAs oder dem Ribosom verändern.“

Also diese Daten habe ich weder von Moderna noch von BioNTech/Pfizer in den bisher veröffentlichten Datensätzen finden können. Vielleicht kommt da ja noch irgendwann was nach?

Neeee, wohl eher nicht.

Es war also im Januar 2020 bereits davon auszugehen, dass die Änderung der mRNA-Struktur zu einer modRNA-Struktur die Interaktion mit anderen Biomolekülen im weitesten Sinne verändern wird (und ich setze hier mit Absicht kein komme, um den Satz mehrdeutig zu lassen).

Könnte es sein, dass Probleme verursacht wurden, von denen wir nicht einmal wissen, dass sie existieren, weil wir nicht wissen, dass es da überhaupt Probleme geben kann?

Hat man das in den klinischen Studien bedacht?

Vermutlich nicht?

“Solche Studien werden von entscheidender Bedeutung sein, wenn die Forscher beginnen, die Art und das Ausmaß der Auswirkungen von mRNA-Veränderungen auf die Biologie zu verstehen.“

Ja, ganz besonders, wenn sie selbst mehrfach mit dem Zeugs geschlumpft sind, da bekommt der Begriff, der im Original verwendet wird, eine ganz andere Bedeutung, denn da steht auf Englisch: „such studies will be vital“. Vital = lebenswichtig und nicht nur von entscheidender Bedeutung.

Wenn das mal nicht ein Ansporn ist ein paar Wochenenden im Labor einzulegen und ein bisschen länger zu arbeiten, dann weiß ich auch nicht.

AKTUELLE QUANTITATIVE PERSPEKTIVE AUF mRNA-ÄNDERUNGEN

„Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass mehrere mRNA-Modifikationen, die relativ häufig vorkommen, die mRNA-Struktur beeinflussen und die Art und Weise beeinflussen können, wie Proteine und das Ribosom mit Transkripten interagieren.“

Ich glaube, dieser Satz ist selbsterklärend und sehr einfach zu verstehen, selbst für Ugur. Der hat ihn aber leider nicht gelesen, schätze ich.

In diesem Kapitel geht es dann wieder hauptsächlich um m6A, weil es für die anderen modifizierten Nucleotide kaum Daten gibt.

Aber, die Modifikationen scheinen konserviert zu sein und man weiß wenig darüber wie oft sie in bestimmten mRNAs verbaut werden. Von Ψ, mit dem Karikó gearbeitet hat, weiß man, dass es sehr häufig verbaut wird: „Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Häufigkeit des Einbaus von Ψ, zumindest an einigen Stellen, wahrscheinlich hoch ist.“

Nur Dummerweise hat man m1Ψ verbaut, und davon weiß man das halt nicht.

Hätten sie nur Ψ genommen, da hätte man wenigstens ein bisschen mehr Daten als für m1Ψ.

Aber das wäre nicht so intellektuell „aufregend für die Forscherseele“ (frei zitiert nach Project Lightspeed S. 101) unseres Ugur gewesen.

Auswirkungen von mRNA-Veränderungen auf die Übersetzung

„Die Entschlüsselung der Auswirkungen von mRNA-Veränderungen auf die Translation in biologischen Systemen war aus mehreren Gründen eine Herausforderung. […] Die Heterogenität bei der Belegung von Modifikationen erschwert es den Forschern, die Translation modifizierter Transkripte in vivo direkt zu beobachten. Schließlich kann es problematisch sein, die Auswirkungen der Translation von der Protein- und mRNA-Stabilität auf die Proteinproduktion in Zellen vollständig zu entschlüsseln. So sind reporterbasierte Studien zu widersprüchlichen Schlussfolgerungen darüber gelangt, wie verschiedene Modifikationen die Translation beeinflussen. […]

Erste In-vitro-Studien mit unterschiedlicher Auflösung zu einer begrenzten Anzahl von mRNA-Modifikationen deuten darauf hin, dass die Modifikationen die Gesamtgeschwindigkeit und Zuverlässigkeit der Proteinsynthese beeinflussen […]

Der Schweregrad des Defekts bei der Proteinexpression hängt in hohem Maße von der Position der Veränderung innerhalb eines Codons ab - die Proteinausbeute kann je nach Position einer Veränderung innerhalb eines einzelnen Codons um das 25-fache schwanken. […]

Diese Veränderungen wirken sich auf mehrere Schritte des kinetischen Weges der Ribosomen aus. […]

Weitere Arbeiten müssen durchgeführt werden, um die Beziehung zwischen den unterschiedlichen Beobachtungen bei In-vitro- und Ribosomen-Profilierungsstudien in Einklang zu bringen.

Da Modifikationen die grundlegenden Eigenschaften von RNAs, einschließlich ihrer Sekundärstrukturen und Basenpaarungsfähigkeiten, verändern können, wurde vorgeschlagen, dass eine Folge der mRNA-Modifikation darin bestehen könnte, den Einbau mehrerer Aminosäuren an einem einzigen Codon zu fördern. […]

mRNA-Veränderungen können sowohl die Geschwindigkeit als auch die Treue der Translation beeinflussen. Wie diese Veränderungen zur Biologie beitragen, ist noch nicht geklärt.“

Im Klartext, sehr viele Worte, um zu beschreiben, was man alles nicht weiß, statt zu sagen, dass man eigentlich noch gar nichts weiß.

“Eine Folge der mRNA-Modifikation darin bestehen könnte, den Einbau mehrerer Aminosäuren an einem einzigen Codon zu fördern.”

DAS wurde letztendlich in einem Nature Paper auch für die Plörre belegt [ii], bzw. dass es durch die Modifikationen zumindest zu Rasterschubmutationen kommt, wenn auch nicht direkt zum Einbau mehrerer Aminosäuren an einem Codon. D.h. durch einen Lesefehler wegen der mRNA-Modifikationen springt das Ribosom von Leseraster 1 in Leseraster 2, in welchem sich bei der Plörre leider kein Stopp-Codon befindet, wie man das eigentlich gelernt hätte, hätte man Ahnung von Protein Engineering.

8% der Proteine waren betroffen und 1/3 der Geschlumpften hatten entsprechende alternative Protein anhand einer Antikörperanalyse. Bei Astra Geschlumpften passierte das NICHT, es liegt also an der modRNA.

Und genau davor hat die Nobelpreisträgerin Karikó übrigens auch gewarnt, man kann es kaum glauben:

EN: Potent cryptic T cell epitopes may be generated when the IVT mRNA is translated in different frames owing to ribosomal frame-shifting or when translation is initiated either internally or from a CUG start codon. [iii]

DE: Potente kryptische T-Zell-Epitope können entstehen, wenn die IVT-mRNA aufgrund von ribosomalem Frame-Shifting in verschiedenen Frames translatiert wird oder wenn die Translation entweder intern oder von einem CUG-Startcodon aus eingeleitet wird.

Man kann jetzt nicht wirklich behaupten, dass das komplett überraschend käme, zumal aus den EMA Unterlagen bereits klar war, dass etwas mit der Größe des Spike-Proteins nicht stimmen konnte.

Zusätzlicher Verbau von Aminosäuren in Proteine dürfte ebenfalls sehr „interessante“ Effekte auf die Struktur haben, schätze ich? Wurde bisher aber noch nicht nachgewiesen.

Sogar die verschiedenen Messungen widersprechen sich in ihren Ergebnissen. Es gibt nicht einmal etablierte Messmethoden, die zu einem eindeutigen Ergebnis führen würden.

Wie genau wurden entsprechende Studien in Zellkultur für die Plörre dann von Moderna und BioNTech/Pfizer durchgeführt? Möglicherweise gar nicht?!

DAS haben dann Wissenschaftler aus der University of Cambridge in UK für BioNTech/Pfizer erledigt.

Änderungen der mRNA-Protein-Wechselwirkungen

„Viele RNA-bindende Proteine interagieren mit einer Vielzahl von mRNA-Sequenzen, und selbst kleine Störungen der Affinität haben das Potenzial, das zelluläre Umfeld und damit das Schicksal einer Vielzahl von mRNAs zu verändern“

Wie genau beeinflusst dabei die „Codonoptimierung“ und das Ersetzen von U mit m1Ψ diese RNA-bindenden Proteine? Könnte es da zu Störungen durch Fehlerkennungen kommen?

„Trotz der Entdeckung mehrerer Proteine, die mit modifizierten mRNAs interagieren, ist weniger klar, inwieweit Modifikationen die mRNA-Protein-Interaktionen verändern.“

Na dann ist ja gut.

Conclusion

„Der Bereich der Epitranskriptome schlägt schnell ein neues Kapitel auf, indem er durch die Entdeckung von Modifikationen die biologischen Rollen und Mechanismen einer breiten Palette von mRNA-Modifikationen untersucht. […]

Der nächste Horizont für das aufstrebende Feld der mRNA-Modifikation ist die Etablierung einer Sichtweise auf molekularer Ebene, wie Modifikationen die Interaktionen zwischen mRNAs und der zellulären Maschinerie verändern. […]

Die Möglichkeit, die Interaktionen von vollständig modifizierten/unmodifiziertenmRNAs mit gereinigten Komponenten zu vergleichen, wird besonders wertvoll sein, wenn man bedenkt, wie schwierig es ist, transkriptomweite Kartierungs-, Halbwertszeit- und Ribosomenprofilierungsdaten für heterogene Populationen von substöchiometrisch modifizierten mRNAs zu interpretieren. […]

Transkriptomweite Studien werden letztlich erforderlich sein, um die biologischen Folgen des Epitranskriptoms zu ermitteln.“

Eigentlich hätte Ugur nur die Conclusion lesen müssen, um zu erkennen, ganz blöde Idee, was er da abziehen will.

DAS waren nur meine „Highlights“ aus der Publikation. Wer es genau wissen will, muss halt das Original komplett lesen.

Der WHO ist das Problem mit den unnatürlichen dNTPs bekannt:

*reg-considerations-on-rna-vaccines_1st-draft_pc_tz_22122020.pdf

[i] McKernan, K., Kyriakopoulos, A. M., & McCullough, P. A. (2021, November 25). Differences in Vaccine and SARS-CoV-2 Replication Derived mRNA: Implications for Cell Biology and Future Disease. https://doi.org/10.31219/osf.io/bcsa6

[ii] Mulroney TE, Pöyry T, Yam-Puc JC, Rust M, Harvey RF, Kalmar L, Horner E, Booth L, Ferreira AP, Stoneley M, Sawarkar R, Mentzer AJ, Lilley KS, Smales CM, von der Haar T, Turtle L, Dunachie S, Klenerman P, Thaventhiran JED, Willis AE. N¹-methylpseudouridylation of mRNA causes +1 ribosomal frameshifting. Nature. 2023 Dec 6. doi: 10.1038/s41586-023-06800-3. Epub ahead of print. PMID: 38057663. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38057663/

[iii] Sahin U, Karikó K, Türeci Ö. mRNA-based therapeutics--developing a new class of drugs. Nat Rev Drug Discov. 2014 Oct;13(10):759-80. doi: 10.1038/nrd4278. Epub 2014 Sep 19. PMID: 25233993. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25233993/

Ich habe das Huaier Paper[1] bisher nur am Rande wahrgenommen, da ich kein Arzt bin und Behandlung nicht meine Baustelle war und ist. Ich habe nur zur Kenntnis genommen, dass dieser Pilz namens Huaier das Problem, welches die japanische Gruppe identifizierte, behoben hat. Damit war das für mich erst einmal erledigt und unter potentielle Problemlösung, sollten wir an den Pilz kommen, verbucht. Es gab damals Diskussionen, dass eine regionale Alternative der Birkenporling (Fomitopsis betulina) sein könnte. Daten liegen aktuell nicht vor.

Was mir damals bei dem erwähnten Paper nicht aufgefallen war und mich damals ehrlich gesagt auch noch nicht interessierte, weil nicht mein Problem, war folgender Satz:

Es wurde eine signifikante Zerstörung der ribosomalen RNA-Strukturen festgestellt, die durch Serienimpfungen verstärkt wurde. Im Gegensatz zur Zerstörung durch die Chemotherapie mit dem Platin(II)-Komplex wurde eine fortschreitende Zerstörung des 18S-Ribosoms auch noch 6 Monate nach der Impfung festgestellt. (A significant destruction in ribosomal RNA structures was identified, enhanced by serial shots. Unlike the destruction caused by chemotherapy with platinum (II) complex, progressive destruction in 18S ribosome was identified even at 6 months after vaccination.”)

18S Ribosom. Da war doch was aus dem ersten Semester. Ich kann mich dunkel an Lernkarten erinnern mit den unterschiedlichen Ribosomen bei Eukaryoten und Prokaryoten und Mitochondrien und dass die Summe der Einzelteile nicht die Zahl des Namens ergab.

Ribosom, was ist das?

Ribosomen sind, grob gesagt, Proteinfabriken. Sie stellen die Bausteine/ Proteine her, die die Zelle braucht, um zu funktionieren. Einige Bestandteile der Ribosomen haben noch ein paar Nebenjobs[2], wie „Zellproliferation, Differenzierung, Apoptose, DNA-Reparatur und andere zelluläre Prozesse“.

Ribosomen sind echt komplex aufgebaut, daher kein wirklich beliebtes Thema und und an der Uni nicht im Detail gelehrt. Auch da vereinfacht man gerne auf die lustigen Bildchen, die man so aus dem Schülerduden kennt mit den zwei Hälften des Ribosoms und den drei Beladestellen. Schemazeichnung halt.

Ehrlicher Weise muss man ja sagen, es steht „MODELL“ drüber. Beschweren kann man sich da eigentlich nicht.

Im Studium ahnt man im ersten Semester zumindest, dass die Angelegenheit tückischer ist, als einem das Schulbuch weiß machen wollte. Die verschiedenen Organismenformen haben unterschiedliche Ribosomen. Die lernt man für die Prüfung auswendig und vergisst sie danach wieder.

1.      eukaryotische cytosolische Ribosomen (also die Ribosomen die in der Zelle mit Zellkern herumschwimmen) nennt man 80S Ribosomen.

Sie bestehen aus den zwei Untereinheiten aus dem Modell. Im Falle der 80S Ribosomen aus der kleinen 40S und der großen 60S Untereinheit, was zusammenaddiert, leider nicht 80S ergibt. Das hat aber historische, experimentelle Gründe.

2.      Die prokaryotischen (bakteriellen) Ribosomen nennt man 70S Ribosomen. Sie bestehen auch aus einer kleinen Untereinheit namens 30S und einer großen Untereinheit namens 50S, was leider aufsummiert 80S ergibt, aber leider zum 70S Ribosom gehört. An dieser Stelle bekam ich immer einen Knoten im Hirn.

3.      Die mitochondrialen Ribosomen, also die Ribosomen unserer Zellkraftwerke sind wieder andere Ribosomen, sogenannte 55S Ribosom mit der kleinen Untereinheit 28S und der großen Einheit 39S.

Die Endosymbiontentheorie oder warum haben Mitochondrien noch Ribosomen?

Eine Theorie, die man ebenfalls im ersten Semester lernt ist die Endosymbiontentheorie.

Diese Theorie geht davon aus, dass eine große Zelle mit Zellkern eine kleinere Zelle, möglicherweise ein Bakterium gefressen hat, sich dann aber entschieden hat, es nicht zu verdauen, sondern als Haustier zu halten bzw. zu versklaven, daher finde ich den Begriff „Symbiose“ hier eher falsch gewählt. Wer auch immer gefressen und dann nicht verdaut wurde und zum Mitochondrium (Kraftwerk) der Zelle war, kann nicht mehr gesagt werden. Dieser Organismus als Einzellebewesen scheint nicht mehr zu existieren. So gesehen, hat diese Partnerschaft diesen Organismus vom Aussterben bedroht. Das Mitochondrium hatte dafür aber einen hohen Preis zu zahlen. Es ging einen Deal mit der Zelle ein, der besagt, dass das Mitochondrium einen Teil seines Genoms an den Zellkern ausliefern musste, wohl damit es nicht mehr verschwinden kann. Vielleicht war es auch reine Bequemlichkeit, gewisse Produktionsaufgaben an den Zellkern auszulagern und so mehr Freizeit zu haben. Daraus erwuchs eine wechselseitige Abhängigkeit bis in den Tod.

Das Ribosom ist auf Gedeih und Verderb darauf angewiesen, dass der Zellkern über die 80S Ribosomenfabrik der Zelle, dem Mitochondrium Baumaterialien liefert, die dieses zum überleben und teilen braucht.

Der Zellkern bzw. der Rest der Zelle, ist auf die Energieproduktion und Energielieferung der Ribosomen angewiesen, weil sie sonst nicht arbeiten und nicht produzieren können. Es wäre also selbstmörderisch vom Rest der Zelle, wenn es die Warenlieferung (Proteine) an die Mitochondrien einstellt, genauso wie es selbstmörderisch für das Mitochondrium wäre, die Energieproduktion einzustellen, weil es sonst keine Baumaterialien mehr bekommt. Do ut des, würde der Lateiner sagen, ich gebe, damit du gibst.

Ribosomopathie

Nun ist es aber so, dass der Rest der Zelle, den Vertrag mit den Mitochondrien unfreiwillig, durch externe Eingriffe dazu gezwungen, gebrochen zu haben scheint.

Im Huaier Paper steht, dass das Impfung mit modRNA, das 18S Ribosom kaputt ist. Schaut man in die Tabelle, wo man 18S findet, stellt man fest, is wohl komplexer, da muss es noch weitere Unterteilungen der Ribosomen geben, die weder in der Schule noch an der Uni gelehrt wurden zu meiner Zeit.

Die Untereinheiten bestehen jeweils aus Komplexen von RNA, die man ribosomale RNA nennt oder kurz rRNA und daran gebundene Proteine.

Dass Untereinheit und rRNA mit der geleichen Maßeinheit (S) versehen gelistet werden, macht es nicht übersichtlicher.

Die Im Huaier Paper erwähnte 18S rRNA findet man in der kleinen Untereinheit der eukaryotischen Ribosomen. Also die kleine, untere Hälfte der Proteinfabrik ist kaputt.

Warum?

Ein Hinweis findet sich vielleicht hier:

Ein N1-modifiziertes Ψ-Derivat handelt ist N1-Methyl-Ψ, eine natürlich vorkommende Modifikation in der 18S rRNA (N1-modified Ψ-derivative is N1-methyl-Ψ, a naturally occurring modification found in 18S rRNA)[3].

Sowohl Comirnaty (BioNTech/Pfizer) als auch Spikevax (Moderna) verwenden das 1mΨ abgekürzte Nucleotid (RNA/DNA-Baustein).

Die Zelle kann diese Art Nucleotid auch selbst herstellen. Das tut sich auch. Selten. Sehr konserviert an ganz, ganz bestimmten Stellen. Wehe, das wird wo anders eingebaut. Wie genau diese modifizierten Bausteine Einfluss nehmen und wo sie überall verbaut sind, ist aktuell unbekannt. Man hat aber eine grobe Ahnung von ihrer Funktion und dass sie wohl häufiger verwendet werden als gedacht. Aber halt KONSERVIERT, also sehr sparsam und selektiv.

Durch die modRNA, bei welcher angeblich jedes Uracil (U) durch ein 1mΨ ersetzt wurde, wurden sehr, sehr viele 1mΨ in die Zellen eingebracht.

Zellen neigen zum Recycling von Baustoffen.

Wird RNA abgebaut, bleiben Baustoffe über.

Diese Baustoffe wird man wiederverwenden in anderer RNA wie rRNA.

Das ist, als wenn man echte LEGO-Steine mit den billigen China-Imitaten (1mΨ) mischt. Das Modell wird wackelig und hält nicht, wenn der Klemmstein überhaupt halbwegs hält.

Normalerweise finden die Modifikationen an der RNA, die U zu über Ψ zu 1mΨ wohl erst nach der Synthese der entsprechenden RNA Struktur statt. So habe ich das zumindest verstanden: „diese Änderungen werden typischerweise in einer posttranskriptionellen Posttranskriptionsreaktion eingeführt, wobei nur wenige Beispiele für cotranskriptionellen Modifikation bekannt sind.[4]“

Nun ist der Baustein aber bereits vor Verbau modifiziert.

Merkt die Zelle das?

Ich befürchte nein. Belegen kann ich das aktuell aber nicht, außer, dass die Datenlage darauf hindeutet.

So wie das Huaier Paper andeutet, wird möglicherweise 1mΨ einfach wie normales U verbaut und die Zelle merkt das nicht. Damit ist zu viel 1mΨ in der 18S RNA und das an falschen Stellen. Was auch immer diese 1mΨ normalerweise machen würde, scheint nicht mehr der Fall zu sein und diese Untereinheit des Ribosoms ist somit eine durch falschen Baustoff bedingte Fehlkonstruktion, die nicht funktioniert, weil möglicherweise strukturell verzogen.

Das hat nun möglicherweise 2 Folgen:

1.      Ribosomomathie, eigentlich ein Erbkrankheit, die natürlicherweise normalerweise auf einzelne Organe beschränkt ist und von Geburt an besteht.

2.      Mitochondriopathie, weil die Mitochondrien keine Baustoffe mehr geliefert bekommen. Die Lieferkette ist wegen Fehlfunktion der Fabrik abgebrochen.

Schaut man einmal welche Untereinheiten der Ribosomen an einer Ribosomopathie mit Schuld tragen können, ist 18S mit dabei[5].

Der Haken an der Geschichte ist jedoch, dass es ich normalerweise um eine Erbkrankheit handelt und normalerweise nur einzelne Organe betrifft, der Rest des Körpers funktioniert.

Im Falle der modRNA-Experimente beträfe das Problem sowohl junge, sich entwickelnde Organismen als auch bereits Erwachsene und zwar in allen nur denkbaren Organen und Strukturen.

Schaut man sich die möglichen gesundheitlichen Effekte einer Ribosomopathie[6] an, findet man viele gute, alte Bekannte aus der bekannten, mehrseitigen Nebenwirkungsliste:

·        Anämie

·        Herzmalformationen (bei Kindern geimpfter Mütter bekannt)

·        Cytopenie

·        Hautverfärbungen

·        Zahnverlust/Zahnprobleme

·        Haarverlust

·        Hörverlust

·        Leberzirrhose

·        Osteoporose

·        Immundefekte

·        Neutropenie

·        Thrombocytopenie

·        Neurologische Defekte

…

Es macht nun einen Unterschied, ob die Ribosomopathie von Geburt an besteht oder erst im Erwachsenenalter entsteht. Das Schadensbild wird unterschiedlich sein.

Und wo wir schon dabei sind, schaut so aus, als wenn es eine p53- Verbindung[7] gibt. Da war doch auch was mit dem Spike-Protein und p53[8]? Ganz abgesehen, dass gestresste Ribosomen, diesen Pathway aktivieren[9] und dieser zu „p53-abhängigem Zellzyklus-Stillstand und Apoptose[10]“ führt.

Menschen mit Ribosomopathie neigen auch stärker zur Krebsentwicklung.

Mitochondriopathie ein Downstream Problem?

Viele Ärzte und Wissenschaftler haben sich in den letzten Monaten und Jahren auf die Mitochondrien fixiert, weil deren Probleme auffällig und messbar sind in mehr oder minder normalen Laboranalysen.

Ich habe daher auch zunächst geglaubt, dass es hauptsächlich die Ribsomen der Mitochondrien zerlegt hätte, das erschien mir logisch. Ich hätte schauen sollen, wo die 18S Untereinheit hingehört. Mea Culpa.

Ja, die Mitochondriopathie ist real, ABER möglicherweise „nur“ ein downstream Problem, d.h. sie ist meiner Hypothese nach „nur“ ein Symptom, das einen Rattenschwanz an Erkrankungen nach sich zieht ABER nicht die Ursache der Erkrankungen an sich.

Die Zelle hat den Liefervertrag mit den Mitochondrien über Baumaterialien nicht eingehalten. Die Mitochondrien haben nun ein Problem mit dem Outsourcing, das bisher doch so super funktioniert hat. Das ist in etwa so, wie die Pharma viele Rohstoffe in Billiglohnländern herstellen lässt, wie Indien. Funktioniert super und spart kosten und Arbeit, solange die Lieferkette funktioniert. Liefert das Billiglohnland Indien, China oder 80S-Ribosom nicht mehr, hat man ein Problem und einem bricht die Versorgung mit Medikamenten in Deutschland oder der EU zusammen. Sieht bei Mikrochips aktuell ähnlich aus. Outsourcing und nicht vorhandene Lagerhaltung rächen sich bei Lieferkettenabbrüchen. Vor diesem Problem steht nun die EU und das Mitochondrium. Wie soll das Mitochondrium Energie herstellen, wenn es Probleme mit dem Baumaterial seiner Kraftwerke hat? Wie soll das Mitochondrium sich teilen und mehr Kraftwerke erzeugen, wenn es dafür keine Bausteine hat?

Sind die 12S und 16S RNA auch betroffen? Im Huaier Paper steht:

„Mit der Gleichen schlechten Qualität von 28S/18S oder 23S/16S Werten als unter dem Standard evaluiert. “with the same poor quality of 28S/18S or 23S/16S values evaluated also as under standard.”

16S wäre laut der obigen Tabelle die große Untereinheit der mitochondrialen Ribosomen. Die Ribosomen wären also zweifach gef***. Zum einen durch Lieferengpässe zum anderen durch die eigenen kaputte Produktionsmaschinerie. DAS steht nicht so explizit im Abstract und beträfe Proteine der Atmungskette, die teilweise noch vom Mitochondrium selbst hergestellt werden, so gut es eben halt noch geht. Überbrücken kann man diese Lücken möglicherweise mit Methylenblau, um die Energieversorgung der Zelle noch so halbwegs am Laufen zu halten, mit dem, was noch soweit funktionstüchtig als Altbestand vorhanden ist.

Wir haben hier also ein Problem, bei dem sich die Katze in den Schwanz beißt.

Die Zelle bzw. der Mensch hat massive Probleme, weil die Mitochondrien nicht korrekt beliefert werden. Man müsste also das Problem an der Wurzel packen und zusehen, dass man die 18S RNA wieder flottbekommt, damit die 80S Ribosomen wieder produzieren können und damit die Ribosomen sich vielleicht wieder teilen und vermehren können, um die Energieproduktion wieder aufzunehmen. Ob eine alleinige Unterstützung der Ribosomen reichen würde, das Problem zu beheben, damit die 80S Untereinheit wieder anspringt, wage ich zu bezweifeln.

Der Huaier Pilz scheint das Problem irgendwie zu lösen mit was auch immer aus seinen Bestandteilen

Eine andere Möglichkeit wäre vielleicht, dass die Zelle das überschüssige 1mΨ los werden muss. Fasten scheint da aus praktischen Erfahrungen sehr gut zu wirken, weil die Zellen dann in den Aufräummodus gehen und alles, was gerade akut nicht gebraucht wird, nach und nach verbrennen.

Ohne das störende 1mΨ könnte es sich vielleicht auch wieder von alleine regulieren.

Fasten + Heilpilze währe auch eine Überlegung wert.

Das traurige Fazit:

Wir haben es bei den Impfnebenwirkungen möglicherweise nicht „nur“ mit

1. Mitochondriopathie

sondern auch mit einer

2.      Ribosomopathie

zu tun. Hinzu kommen erschwerend:

3.      Autoimmunreaktionen jeglicher Art an jeder möglichen Stelle

4.      Thrombosen jeglicher Art an jeder möglichen Stelle

5.      fehlgefaltete Proteine unbekannter Art und Menge und den daraus resultierenden Krankheitsbildern, überall im Körper

6.      einem toxischen Protein, das auch noch über ACE2 weiteren Schaden an den Mitochondrien anrichten kann.

Und wenn es dumm läuft, passiert alles gleichzeitig.

DAS ist aber nur eine Hypothese basierend auf den vorhandenen Daten, die mir bekannt sind. Wahrscheinlich gibt es da draußen noch mehr Infos, die ich nicht kenne. Man müsste das nun sauber im Labor nachweisen, vielleicht mit radioaktiv markiertem 1mΨ, um zu schauen, ob man es wirklich in der rRNA nachweisen kann. Das mit dem potentiellen Recycling der modRNA Nucleotide und den daraus resultierenden Problemen hätte BioNTech/Pfizer oder Moderna eigentlich vorher klären sollen, bevor sie solche Nucleotide zum Einsatz gebracht haben.

[1] Huaier Effects on Functional Compensation with Destructive Ribosomal RNA Structure after Anti-SARS-CoV-2 mRNA Vaccination. (n.d.). https://www.fortunejournals.com/articles/huaier-effects-on-functional-compensation-with-destructive-ribosomal-rna-structure-after-antisarscov2-mrna-vaccination.html

[2] Wang W, Nag S, Zhang X, Wang MH, Wang H, Zhou J, Zhang R. Ribosomal proteins and human diseases: pathogenesis, molecular mechanisms, and therapeutic implications. Med Res Rev. 2015 Mar;35(2):225-85. doi: 10.1002/med.21327. Epub 2014 Aug 28. PMID: 25164622; PMCID: PMC4710177.https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4710177/

[3] Morais P, Adachi H, Yu YT. The Critical Contribution of Pseudouridine to mRNA COVID-19 Vaccines. Front Cell Dev Biol. 2021 Nov 4;9:789427. doi: 10.3389/fcell.2021.789427. PMID: 34805188; PMCID: PMC8600071. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34805188/

[4] Motorin Y, Helm M. RNA nucleotide methylation. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2011 Sep-Oct;2(5):611-31. doi: 10.1002/wrna.79. Epub 2011 Mar 23. PMID: 21823225. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21823225/

[5] Wikipedia contributors. (2023a). Ribosomopathy. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Ribosomopathy

[6] Orgebin E, Lamoureux F, Isidor B, Charrier C, Ory B, Lézot F, Baud'huin M. Ribosomopathies: New Therapeutic Perspectives. Cells. 2020 Sep 11;9(9):2080. doi: 10.3390/cells9092080. PMID: 32932838; PMCID: PMC7564184. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32932838/

[7] Raiser DM, Narla A, Ebert BL (March 2014). "The emerging importance of ribosomal dysfunction in the pathogenesis of hematologic disorders". Leuk Lymphoma. 55 (3): 491–500. doi:10.3109/10428194.2013.812786. PMID 23863123. S2CID 1259487 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23863123/

[8] Zhang Y, Peng X, Xue M, Liu J, Shang G, Jiang M, Chen D, Liu B, Wang Y, Jia X, Xu J, Zhang F, Hu Y. SARS-COV-2 spike protein promotes RPE cell senescence via the ROS/P53/P21 pathway. Biogerontology. 2023 Feb 4:1–15. doi: 10.1007/s10522-023-10019-0. Epub ahead of print. PMID: 36738354; PMCID: PMC9898700. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36738354/

[9] Zhou X, Liao WJ, Liao JM, Liao P, Lu H. Ribosomal proteins: functions beyond the ribosome. J Mol Cell Biol. 2015 Apr;7(2):92-104. doi: 10.1093/jmcb/mjv014. Epub 2015 Mar 3. PMID: 25735597; PMCID: PMC4481666. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4481666/

[10] Wang W, Nag S, Zhang X, Wang MH, Wang H, Zhou J, Zhang R. Ribosomal proteins and human diseases: pathogenesis, molecular mechanisms, and therapeutic implications. Med Res Rev. 2015 Mar;35(2):225-85. doi: 10.1002/med.21327. Epub 2014 Aug 28. PMID: 25164622; PMCID: PMC4710177. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4710177/

JETZT wird es speziell. Das ist mein Wunschzettel an Analysen, die ich bei den Pfizer Daten bisher schmerzlich vermisse. Dieser Artikel richtet sich eher an jene, die ein Labor haben und verstehen, was ich hier gerne hätte. Der normale Leser braucht sich daher nicht zu wundern, wenn er nur noch Bahnhof versteht. Macht euch keine Sorgen, BioNTech/Pfizer haben es auch nicht verstanden.

Es geht mir daher nicht darum, dass der gelegentliche Leser, der sich in diesem fünften Teil verirrt, im Detail versteht, was nicht gemacht wurde. Es geht darum grob zu verstehen, dass grundlegende, teils sehr, sehr alte, etablierte Methoden der Charakterisierung des Produkte NICHT durchgeführt wurden und was alles bisher unbekannt ist.

Man könnte das auch als meinen persönlichen Fragekatalog an BioNTech/Pfizer ansehen. Oder als meinen Weihnachtswunschzettel an mitlesende Wissenschaftler.

Charakterisierung der modRNA

Fragen, die sich mir bezüglich der modRNA stellen und zu denen ich bisher KEINE DATEN gefunden habe wären:

1.      Wieviel % der Uracile wurden durch N1-Methylpseudouridin[1] ersetzt? 100%? 90%? Hat man das bestimmt? Wenn ja, wie hat man das bestimmt?

2.      Kann man die modRNA mit verschiedenen menschlichen RNAsen verdauen? Wie sieht das im zeitlichen Verlauf aus? Z. Bsp. nach 5s, 10s, 30s, 60s? Bitte einmal mit Lipidhülle intakt und einmal ohne Lipidhülle z. Bsp. nach Isoprop:Ethanol Fällung.

3.      Sind miRNA (microRNA) Fragmente enthalten, welche regulatorische Funktion ausüben könnten?

4.      Sind in den Produkten Oncomir Sequenzen enthalten?

5.      Wie groß ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Stop-Codons wegen des verwendeten durch N1-Methylpseudouridin durchgelesen werden oder Rasterschübe passieren?

Integriert die transkribierte modRNA oder die Plasmid-Verunreinigung in den Zellkern?

Mittlerweile ist bekannt, dass das Impfprodukt in den Zellkern integrieren kann.

BioNTech/Pfizer selbst wussten zumindest, dass das Spike-Protein in den Zellkern geht. Das erkennt man am sogenannten FRET-Signal, weil grün + blau andere Farben ergibt, wegen Energieübertragung zischen den Farbstoffen.

[2]

Nicht bekannt ist, was integriert. Die (mittels reverser Transkriptase LINE-1) in DNA übersetzte modRNA oder das als Verunreinigung identifizierte Plasmid[3], welches in der Produktion als Vorlage für die modRNA diente?

Im Prinzip führt man mit diesen Schlumpfungen ein altes, bewährtes Experiment durch, welches man in der Zeit vor der Sequenzierung verwendet hat, um Krebsgene (Oncogene) oder Tumorsuppressorgene zu identifizieren. Man nutzte sogenannte springende Gene (Transposons) oder Retroviren und ließ diese zufällig irgendwo integrieren. Anschließend beobachtete man, ob die Zelle entartete und schaute, welches Gen dadurch zerstört wurde[4].

Mit dieser Methodik könnte man auch herausfinden, was tatsächlich integriert hat und Spike produziert. Wenn man einige der sogenannten „Turbokrebse“ daraufhin untersuchen würde, welches Gen entartet ist, und warum, könnte man identifizieren, was (Plasmid oder transkribierte modRNA) wo integriert hat. Kann man die transkribierte modRNA nachweisen? Kann man modRNA nachweisen? Kann man das Plasmid nachweisen?

Das Problem der potentiellen Integration des „Impfstoffes“ in das Genom ist durchaus bekannt.[5]

Das wäre einfach mit Northern[6] (RNA-Nachweis) und Southern Blots[7] (DNA-Nachweis) möglich.

Aufgrund der Plasmidverunreinigung ist es aktuell unklar, ob das von Pathologen nachgewiesene Spike Protein tatsächlich von der stark modifizierten modRNA hergestellt wird, oder es vielleicht immer die Plasmide waren. Da die erste Schlumpfung auf Plasmidbasis (doppelsträngige DNA) mittlerweile zugelassen wurde, wäre es wichtig zu wissen, ob das modRNA Plasmid überhaupt jemals funktioniert hat oder es immer eine Plasmid-Impfung war wie das indische ZyCoV-D[8]. Damit wäre potentiell die komplette modRNA Plattform in Frage gestellt.

Grundlegende Proteincharakterisierung

Exprimieren Blutzellen das Spike Protein

Man könnte recht einfach mittels FACS[9] herausfinden, ob Blutzellen Geimpfter (welcher Art auch immer) das Spike-Protein an ihrer Oberfläche präsentieren.

Bildet das Spike Multimere?

Meiner eigenen Laborerfahrung nach können Proteine, die aus mehreren Untereinheiten bestehen, verschiedene Varianten in einem dynamischen Gleichgewicht ausbilden. Bei einem Trimeren Protein (also ein Protein aus drei Untereinheiten) theoretisch in einem Monomer-Dimer-Trimer- Hexamer-Nonamer-Gleichgewicht stehen. Das könnte man auf einer Sephadex 200 Säule sehen, wenn dieses Verhältnis entsprechend stabil ist. In meiner Promotion war es ein Trimer-Hexamer-Nonamer Gleichgewicht.

Wie es beim Spike aussieht, ist unbekannt.

[10]

Erschwerend kommt hinzu, dass hybride Spikes durch Kreuzimpfung zu erwarten sind, da die Spike-Protein der verschiedenen Hersteller sich minimal unterscheiden.

BioNTech/Pfizer unterscheidet sich von Moderna und Janssen durch die Codonoptimierung, was zu unterschiedlichen Konformationen führen kann.

AstraZenecas Spike hat kein Prolin-Schloss.

Es kann also bei einer Kreuzimpfug von Jannsen, AstraZeneca, BioNTech/Pfizer, BioNTech/Pfizer Bivalent zur Bildung von Trimeren aus minimum vier verschiedenen Untereinheiten kommen. Wie sich entsprechende hybride Spike-Proteine verhalten ist unbekannt. Zusätzlich handelt es sich um ein dynamisches Gleichgewicht mit häufigem Partnerwechsel unter den Untereinheiten, denn alles fließt.

Welche Schmelz- oder Denaturierungstemperaturen hat das Spike?

Proteine können ausflocken/denaturieren. Es gibt Hitzedenaturierung, wie man das vom Rührei kennt, aber es gibt auch Kältedenaturierung, also dass ein Protein ausflockt, weil ihm zu kalt ist.

Es gäbe einfache, low tech Möglichkeiten einen groben Überblick zu bekommen, wie sich das Spike-Protein bei verschiedenen Temperaturen verhält.

Hitzedenaturierung wäre im menschlichen Körper kein Problem, denn die ersten unserer körpereigenen Proteine denaturieren um die ca. 43°C. So ein hohes Fieber kann tödlich enden, weil eben lebenswichtige Protein ausfallen. Wäre das Spike-Protein thermostabil, würde das in dieser Hinsicht kein Problem darstellen.

Das Problem jedoch ist, dass vor allem thermostabile Proteine gerne kältedenaturieren, also bei einstelligen Temperaturen bereits ausflocken. Das war damals in der Promotion eines meiner Probleme. Mein Protein mochte es kuschelig warm von 37°C aufwärts. 4°C hat es ausflocken oder regelrecht fest werden lassen. Man konnte das Reagenzglas umdrehen und es blieb als feste, leicht trübe Substanz drinnen haften.

Es wurde beobachtet, dass Serum geimpfter Personen im Kühlschrank fest werden kann. Das ist der Effekt, den ich bei meinem Protein beobachtet habe und könnte somit auf ein kältedenaturierendes Protein hinweisen. Das wäre zu klären.

Eine einfache Methode hierfür wäre, Spike Protein, welches aus Impfgeschädigten per Blutwäsche entfernt wurde, verschiedenen Temperaturen auszusetzen. Anschließend, abzuzentrifugieren und dann mittels SDS-Gel und Western-Blot zu prüfen ab welcher Temperatur, das Spike Protein im abzentrifugierten Serum nicht mehr nachweisbar ist.

Eleganter ginge es mit einer CD-Schmelzkuve. CD steht für circular dichroism[11] und damit kann man messen, bei welcher Temperatur ein Protein seine Struktur durch Denaturierung verliert.

So eine CD-Schmelzkurve kann wie folgt aussehen:

[12]

Man könnte auch eine Gefrierkurve fahren, indem man von Körpertemperatur bis auf 0°C herunterkühlt. Ein CD mit entsprechendem Peltier-Element ist aber schwer aufzutreiben.

An was und wie fest bindet das Spike-Protein?

Es wird aktuell spekuliert, dass das Spike-Protein möglicherweise neben dem ACE2-Rezeptor noch andere, sogenannte Co-Rezeptoren haben könnte.

Des Weiteren ist unklar wie fest das Impf-Spike-Protein an den ACE2 Rezeptor bindet und mit welchen Substanzen man es nachweislich wieder vom Rezeptor lösen kann.

Eine einfache und lange etablierte Messmethode stellt Biacore[13] bzw. Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie[14] dar. Damit ließe sich klären, ob und welches der Co-Rezeptor sein könnte (DPP4 steht im Verdacht) und ob das Spike den ACE2-Rezeptor zerstört oder wieder von diesem gelöst werden kann.

Messungen, die für Proteinfaltungsuntersuchungen wichtig wären

Was ansonsten zu bestimmen gewesen wäre, z. Bsp. über HX Pulse Labeling und NMR Spektroskopie[15], HX Pulse und MS Analyse und vieles Andere, womit ich keine Erfahrungen habe. Generell gilt da wohl, was Vendruscolo beschrieben hat:

Es ist daher von großer Bedeutung, die gut etablierte Charakterisierung der Struktur, Faltung und Stabilität nativer Zustände durch eine ähnliche Analyse der Struktur, des Aufbaus und der Stabilität anderer Zustände zu ergänzen - von ungefalteten und teilweise gefalteten Spezies, einschließlich nativ ungefalteter Zustände, bis hin zu aggregierten Spezies wie Amyloidfibrillen.[16]

Nichts von den oben erwähnten Experimenten wurde von BioNTech/Pfizer oder Moderna durchgeführt. Wir wissen nicht ansatzweise, womit wir es genetisch oder biochemisch beim Impf-Spike-Protein zu tun haben. Wir kennen seine grundlegenden Eigenschaften nicht ansatzweise.

ABER es wurden Milliarden von Menschen zu Produzenten eben dieses unbekannten Proteins mit zum großen Teil unbekannten Eigenschaften gemacht.

Labordaten, die von Wichtigkeit wären:

Die Nanolipide (ALC-0315 und ALC-0159) werden nicht nach Arzneimittelhandbuch hergestellt oder kontrolliert. Sie werden nach hauseigenen Regeln kontrolliert.

Welches sind diese Regeln, nach denen die Nanolipide geprüft werden?

Ich hätte gerne die HPLC Laufdateien (nicht die XLS-Daten, die Maschinendaten mit allen Sensoren, also z. Bsp. die Unicorn Dateien), um zu sehen, was sonst noch neben den Nanolipiden enthalten war und wie sauber diese Chemikalien tatsächlich waren, als sie im Menschen zu Einsatz kamen.

Massenspektrometrie des Schweißes von Geschlumpften wäre interessant. Sind Spikes oder Nanolipide im Schweiß nachweisbar?

Falls noch jemand Ideen hat, was an Analysen fehlt: Einfach in die Kommentare schreiben.

[1] Wikipedia-Autoren. (2021b). N1-Methylpseudouridin. de.wikipedia.org. https://de.wikipedia.org/wiki/N1-Methylpseudouridin

[2] https://www.tga.gov.au/sites/default/files/foi-2389-06.pdf

[3] McKernan, K., Helbert, Y., Kane, L. T., & McLaughlin, S. (2023, April 10). Sequencing of bivalent Moderna and Pfizer mRNA vaccines reveals nanogram to microgram quantities of expression vector dsDNA per dose. https://doi.org/10.31219/osf.io/b9t7m

[4] Ranzani M, Annunziato S, Adams DJ, Montini E. Cancer gene discovery: exploiting insertional mutagenesis. Mol Cancer Res. 2013 Oct;11(10):1141-58. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-13-0244. Epub 2013 Aug 8. PMID: 23928056; PMCID: PMC3836224. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23928056/

[5] Doerfler W. Adenoviral Vector DNA- and SARS-CoV-2 mRNA-Based Covid-19 Vaccines: Possible Integration into the Human Genome - Are Adenoviral Genes Expressed in Vector-based Vaccines? Virus Res. 2021 Sep;302:198466. doi: 10.1016/j.virusres.2021.198466. Epub 2021 Jun 1. PMID: 34087261; PMCID: PMC8168329. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8168329/

[6] DocCheck, M. B. (n.d.-d). Northern Blot - DocCheck Flexikon. DocCheck Flexikon. https://flexikon.doccheck.com/de/Northern_Blot

[7] DocCheck, M. B. (n.d.-f). Southern Blot - DocCheck Flexikon. DocCheck Flexikon. https://flexikon.doccheck.com/de/Southern-Blot

[8] ZyCoV-D becomes world’s first plasmid DNA vaccine for COVID-19. (2021, August 23). European Pharmaceutical Review. https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/news/160968/zycov-d-becomes-worlds-first-plasmid-dna-vaccine-for-covid-19/

[9] DocCheck, M. B. (n.d.-b). FACS - DocCheck Flexikon. DocCheck Flexikon. https://flexikon.doccheck.com/de/FACS

[10] FreiDok plus - Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling And Mutational studies on chloramphenicol actetyltransferase I (CATI). (n.d.-b). https://freidok.uni-freiburg.de/data/11610

[11] Wikipedia contributors. (2023b). Circular dichroism. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism

[12] FreiDok plus - Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling And Mutational studies on chloramphenicol actetyltransferase I (CATI). (n.d.-b). https://freidok.uni-freiburg.de/data/11610

[13] Cytiva. (n.d.). Biacore surface plasmon resonance - Cytiva. https://www.cytivalifesciences.com/en/us/support/online-tools/biacore-surface-plasmon-resonance

[14] Cytiva. (n.d.). Biacore surface plasmon resonance - Cytiva. https://www.cytivalifesciences.com/en/us/support/online-tools/biacore-surface-plasmon-resonance

[15] Englander SW, Mayne L. The nature of protein folding pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Nov 11;111(45):15873-80. doi: 10.1073/pnas.1411798111. Epub 2014 Oct 17. PMID: 25326421; PMCID: PMC4234557. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25326421/

[16] Vendruscolo M, Knowles TP, Dobson CM. Protein solubility and protein homeostasis: a generic view of protein misfolding disorders. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec 1;3(12):a010454. doi: 10.1101/cshperspect.a010454. PMID: 21825020; PMCID: PMC3225949. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21825020/

Diese Methode der Manipulation wurde bei der Geschichte der Verwendung von N1-Methylpseudouridin angewandt.

N1-Methylpseudouridin (abgekürzt m1Ψ) ist ein synthetisches Nukleosid (RNA/DNA-Baustein) und kommt in den COVID-19-Impfstoffen von BioNTech/Pfizer und Moderna zum Einsatz statt eines Uracil in der natürlichen mRNA. Nicht zu verwechseln mit Pseudouridine (abgekürzt Ψ), welches sich in Vergleichsuntersuchungen unterschiedlich verhält, aber gerne mit m1Ψ verwechselt oder gleichgesetzt wird.

m1Ψ wird vom Köper auch in sehr speziellen RNAs verwendet wie 18S rRNA (also ribosomale RNA, vielleicht mit eine Ursache für Mitochondriopathie?) und tRNAs. Man weiß also seit 1978, dass 18S rRNA m1Ψ enthält. Es reicht, zu erfassen, dass die Verwendung von m1Ψ in der menschlichen DNA durchaus verbreiteter sein könnte, als bekannt und dass man behauptet hat, dass es sich um ein synthetisches, nicht natürlich vorkommendes Nucleosid handelt und dieses daher sicher wäre. Sieht mir irgendwie sehr natürlich und potentiell sehr häufig aus. Da aber eine Sequenzierung und somit Bestimmung aktuell extrem schwierig ist[1], ist ein Nachweis schwer zu führen, und mögliche unbekannte biologische Funktion daher ebenfalls unbekannt. Ein Satz, in dem das Wort „unbekannt“ gleich zweimal vorkommt, sollte einem Sorgen machen.

Der Unterschied zwischen DNA und RNA besteht darin, dass statt der Base Thymine (T) ein Uracil (U) verbaut wird. Die chemischen Details sind für das aktuelle Problem irrelevant. Man muss nur verstehen, DNA hat Ts und RNA hat Us statt Ts.

Laut den Herstellern wurden angeblich sämtliche U in der mRNA durch m1Ψ ersetzt und die klassische mRNA somit zu modRNA (modifizierter mRNA). Der Beweis jedoch steht aus, da es aktuell, wie bereits erwähnt, sehr schwierig ist, den Einbau von m1Ψ per Sequenzierung überhaupt nachzuweisen. Ob wirklich 100% der Us durch m1Ψ oder nur ein gewisser Prozentsatz ersetzt wurden, wäre noch von Seiten der Hersteller zu belegen.

Ψ erhöht bereits die Stabilität von modRNA, inwieweit m1Ψ sich darin unterscheidet und möglicherweise zu noch höherer Stabilität führt, ist nicht gut untersucht.

Ψ kommt auch natürlich in Zellen vor in sehr konservierter Form und man vermutet, dass diesem Nucleosid spezielle essentielle Funktionen zukommen, da Defekte zu Krankheiten führen können. Ψ ist ein Biomarker für Alzheimer und einige Krebsarten[2].

Die Ursprünglichen Versuche zur modRNA von Kariko und Weissman[3] wurden mit Ψ durchgeführt. Die Eigenschaften von m1Ψ sind in der Literatur deutlich schlechter untersucht und charakterisiert. Bereits 2008[4] wussten diese Autoren, von denen Kariko im Senior Team von BioNTech war[5], dass Ψ die Translation, also die Übersetzung von mRNA (in diesem Fall bereits modRNA) in Proteine erhöht.

Wir haben in Teil 1 der Reihe gelernt:

Die Geschwindigkeit der Translation im Verhältnis zur Faltungsgeschwindigkeit ist von zentraler Bedeutung für den Ausgang und das Ergebnis der co-translationalen Faltung.

Und in Teil 3, dass Proteine in hohen Konzentrationen thermodynamisch instabil sind und daher zur Aggregation neigen

Man wusste also bereit 2008, dass modRNA zu einer deutlich erhöhten Proteinproduktion führt und hat die damit einhergehenden Konsequenzen für die Proteinfaltung ignoriert bzw. nicht untersucht.

Es ist weiterhin bekannt, dass wenn man Ψ in Stop-Codons verbaut, diese überlesen werden können[6] und zu einem größeren Protein mit Strukturen führt, die dieses nicht haben sollte.

Für m1Ψ ist das bisher nicht gut untersucht. Angeblich soll dieses Problem nicht existieren. Dem widersprechen aber die von Pfizer/BioNTech vorgelegten Daten, die zu große Spike Proteine aufweisen, was ein überlesen der Stop-Codons nahe legt[7].

Die EMA hat das mit 190kDA statt 141 KDa und somit deutlich zu großes Protein in ihren Bericht dementsprechend auch gerügt[8]. Das Problem ist also bekannt, wird aber ignoriert. Es könnte sein, dass der Poly-A Schwanz der RNA als Protein mit übersetzt wird, weil das Stop-Codon wegen des verbauten m1Ψ nicht als Stop erkannt und überlesen wird. Wie sich ein derartig verlängertes und verändertes Protein faltet und verhält, wurde bisher leider nicht charakterisiert.

Von m1Ψ ist jedoch bekannt, dass es die Dynamik der Ribosomen beeinflusst und somit die Geschwindigkeit der Proteinproduktion[9]. m1Ψ erhöht die Proteinproduktion noch einmal um das 6fache bis 13fache im Vergleich zu Ψ[10].

Kurzum, man brüstet sich bei der Verwendung von m1Ψ in den Covid-Impfungen von Moderna und BioNTech/Pfizer exakt mit den Eigenschaften, die bei der Proteinfaltung seit Jahrzehnten als Problem bekannt sind:

1. höhere Proteinkonzentration, was zu Aggregation führen kann und

2. Direkte Einflussnahme des m1Ψ auf das Protein produzierende Ribosom auf eine Art und Weise, von der man in der wissenschaftlichen Literatur zugibt, nicht exakt verstanden zu haben[11].

Was kann da schon schief gehen, wenn man gleich an zwei Stellschrauben, von denen man teilweise offen zugibt, sie nicht zu verstehen, ohne Sinn und Verstand herumdreht.

Eine wirklich intellektuell spannende Frage, die sich mir in diesem Zusammenhang auch stellt… 18S ribosomal RNA verwendet m1Ψ... Zellen recyceln Baustoffe gerne, das lernt man im ersten Semester in Zellbiologie im Grundstudium. Was passiert wohl, wenn man plötzlich ein Überangebot an m1Ψ hat, mit der 18S RNA in den Ribosomen der Zelle oder mit der 16S rRNA der Mitochondrien?

Eine Antwort darauf findet man in folgendem Paper:

Huaier Effects on Functional Compensation with Destructive Ribosomal RNA Structure after Anti-SARS-CoV-2 mRNA Vaccination. (n.d.). https://www.fortunejournals.com/articles/huaier-effects-on-functional-compensation-with-destructive-ribosomal-rna-structure-after-antisarscov2-mrna-vaccination.html

Und diese Antwort macht richtig schlechte Laune und verdient einen eigenen Artikel.

Einmal mit Profis arbeiten, kann ich dazu nur sagen.

[1] Dai Q, Zhang LS, Sun HL, Pajdzik K, Yang L, Ye C, Ju CW, Liu S, Wang Y, Zheng Z, Zhang L, Harada BT, Dou X, Irkliyenko I, Feng X, Zhang W, Pan T, He C. Quantitative sequencing using BID-seq uncovers abundant pseudouridines in mammalian mRNA at base resolution. Nat Biotechnol. 2023 Mar;41(3):344-354. doi: 10.1038/s41587-022-01505-w. Epub 2022 Oct 27. PMID: 36302989; PMCID: PMC10017504. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36302989/

[2] Morais P, Adachi H, Yu YT. The Critical Contribution of Pseudouridine to mRNA COVID-19 Vaccines. Front Cell Dev Biol. 2021 Nov 4;9:789427. doi: 10.3389/fcell.2021.789427. PMID: 34805188; PMCID: PMC8600071. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34805188/

[3] Karikó K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005 Aug;23(2):165-75. doi: 10.1016/j.immuni.2005.06.008. PMID: 16111635. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16111635/

[4] Karikó K, Muramatsu H, Welsh FA, Ludwig J, Kato H, Akira S, Weissman D. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Mol Ther. 2008 Nov;16(11):1833-40. doi: 10.1038/mt.2008.200. Epub 2008 Sep 16. PMID: 18797453; PMCID: PMC2775451. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18797453/

[5] Unser Senior Team. (n.d.). https://www.biontech.com/de/de/home/about/our-senior-team.html

[6] Morais P, Adachi H, Yu YT. The Critical Contribution of Pseudouridine to mRNA COVID-19 Vaccines. Front Cell Dev Biol. 2021 Nov 4;9:789427. doi: 10.3389/fcell.2021.789427. PMID: 34805188; PMCID: PMC8600071. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34805188/

[7] https://phmpt.org/wp-content/uploads/2023/02/125742_S1_M4_4.2.1-r-20-0211.pdf Seite 15

[8] https://www.covidtruths.co.uk/wp-content/uploads/2021/04/Rapporteur-Rolling-Review-Report-Overview-LoQ-COVID-19-mRNA-Vaccine-BioNTech.docx S. 61

[9] Svitkin YV, Cheng YM, Chakraborty T, Presnyak V, John M, Sonenberg N. N1-methyl-pseudouridine in mRNA enhances translation through eIF2α-dependent and independent mechanisms by increasing ribosome density. Nucleic Acids Res. 2017 Jun 2;45(10):6023-6036. doi: 10.1093/nar/gkx135. PMID: 28334758; PMCID: PMC5449617. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28334758/

[10] Andries O, Mc Cafferty S, De Smedt SC, Weiss R, Sanders NN, Kitada T. N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice. J Control Release. 2015 Nov 10;217:337-44. doi: 10.1016/j.jconrel.2015.08.051. Epub 2015 Sep 3. PMID: 26342664. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26342664/

[11] Chen TH, Potapov V, Dai N, Ong JL, Roy B. N1-methyl-pseudouridine is incorporated with higher fidelity than pseudouridine in synthetic RNAs. Sci Rep. 2022 Jul 29;12(1):13017. doi: 10.1038/s41598-022-17249-1. PMID: 35906281; PMCID: PMC9335462. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35906281/

Im zweiten Teil haben wir gelernt, warum man von dynamischen, großen Proteinen, deren Struktur und Funktionsmechanismus nicht kennt, die Finger lassen sollte.

Im dritten Teil geht es um das hochgelobte Prolin-Schloss, das angeblich die Struktur des Spike Proteins stabilisieren sollte, damit es, ja, was eigentlich?

Erneut werde ich die Fußnotenanzahl gering halten. Es war Pandemie! Panik! Da hat man nicht viel Zeit zu lesen. Ich werde mich also an die absolut notwendigsten Belege halten, die man an einem Wochenende locker und entspannt hätte lesen können.

Was war noch mal gleich das Prolin-Schloss? In Ugurs „Project Lightspeed“ findet sich dazu folgende Information in seinen Worten oder zumindest von ihm so genehmigt:

„Kurz bevor es an die Lungenzellen andockt, verändert sich das Spike-Protein von einer kompakten distelähnlichen Form in eine Struktur, die eher einem hohen, langgestreckten Kelch gleicht. Hat das Spike-Protein erst einmal an die Zelle angedockt, verändert es erneut seine Form, und ein Teil des Spikes wird ausgefahren wie eine Schnappmesserklinge, mit der es die Zellmembran durchsticht, sodass das Virus in die Zelle eindringen kann. Das Genom gelangt in die Zelle und kann dort vervielfältigt werden. Damit der Impfstoff wirken konnte, musste er also die Kelchform des Spike-Proteins nachbilden. Die Eingreiftruppen des Immunsystems würden so informiert, das Virus anzugreifen, bevor es zum Schnappmesser wurde – der Form also, die es nutzt, um in die Zelle einzudringen. Mit etwas Glück (Hervorhebung von mir) würde so der wirksame Andockprozess des Virus unterbrochen. […] Die Proteinstruktur, abgelöst vom Virus, war von Natur aus nicht formstabil (Hervorhebung von mir). Es war durchaus möglich, dass die körpereigenen Zellen, wenn die mRNA ihnen die Blaupause der Gensequenz für das Spike-Protein lieferte, eine leicht veränderte Struktur zusammenbaute und nicht die exakte Form (S. 103).“ […] „2012 entwickelte [Barney Graham] einen Ansatz, spike-ähnliche Antigene in der Form, die sie vor Eintritt in die Zelle haben, zu bewahren. Das gab Hoffnung, endlich ein sicheres RSV-Vakzin zu finden. (S. 104)“

Hier zitiert der Autor einen Beleg, der nicht zum Text passt. RSV ist kein Coronavirus. Was RSV mit dem Coronavirus zu tun hat, das erklärt er praktischerweise auch nicht.

In diesem Zitat beschreibt der Autor die spekulative Funktionsweise des Prolin-Schlosses[1] [2](prolin lock), wie es von BioNTech/Pfizer geplant war. Man wollte das Spike-Protein ein einer Prä-Fusions Konformation gefangen halten, damit es nicht in die Zelle eindringt.

Das hat übrigens nicht funktioniert. Zwei Proline sind generell instabil und man hat das Spike-Protein aktiv und frei zirkulierend im Blut nachgewiesen[3]. Um die Form zu stabilisieren braucht es wohl 6 Proline[4].

Diese Proline (übrigens essentielle Aminosäuren, die man über die Nahrung zu sich nehmen muss) ziehen aber Probleme nach sich, die hier verschwiegen werden. Der Austausch von 2 Aminosäuren kann die Struktur eines Proteins auf unvorhergesehene Weise verziehen und verändern über sogenannte „Einflüsse über lange Distanz“. Das habe ich in meiner Doktorarbeit selbst erleben dürfen. Zwei Mutationen (I84V und S87R) reichten, meine tote Katze (CAT I) wiederzubeleben.

Ugur weiß das auch, er schreibt es ja selbst:

Die Proteinstruktur, abgelöst vom Virus, war von Natur aus nicht formstabil. Es war durchaus möglich, dass die körpereigenen Zellen, wenn die mRNA ihnen die Blaupause der Gensequenz für das Spike-Protein lieferte, eine leicht veränderte Struktur zusammenbaute und nicht die exakte Form (S. 103).“

Wenn man es genau nimmt, schreibt Ugur da sogar, dass anhand seiner mRNA ein anderes Protein herauskommt, als das natürliche Spike. Was diese Unterschiede für Folgen nach sich ziehen könnten hat er aber nicht auf dem Schirm. Er scheint nicht einmal zu ahnen, dass es ein Problem sein könnte, wenn ein Protein nicht formstabil ist. Er ahnt nichts, von den zugrundeliegenden dynamischen Gleichgewichten bzw. er ist nicht reflektiert genug, an dieser Stelle kurz innezuhalten und nachzudenken, was er da gerade geschrieben hat.

Woher kam die schwachsinnige Idee zum Prolin-Schloss eigentlich ursprünglich?

Dieses Prolin-Schloss ist vom NIH (National Institute for Health) Patentiert unter Patentnummer US10960070B2[5]. Patenthalter ist unter anderem der in Ugurs Buch erwähnte Barney Graham.

Es wurden basierend auf diesem Patent zwei Aminosäuren gegen Proline ausgetauscht K986P und V987P[6].

Graham arbeitet für das NIH, das National Institute for Health, Faucis Königreich in den USA. Moderna hat für die Verwendung des Prolin Schlosses von Graham Lizenzgebühren gezahlt bzw. zumindest einen nicht-exklusiven Lizenzvertrag abgeschlossen[7] und das für ein nicht funktionierendes Produkt. Inwieweit BioNTech/Pfizer ebenfalls möglicherweise Lizenzgebühren gezahlt haben ist unbekannt. Es wird aber offensichtlich, dass bei der Verwendung des Prolin-Schlosses ein möglicher finanzieller Vorteil für Faucis US-Behörde entstanden sein könnte. Die Behörde, die mit drakonischen Vorschriften dann die US Behörde in die Spritze getrieben hat.

Leider wurden von Seiten BioNTech/Pfizer keine Daten vorgelegt, ob das Prolin-Schloss überhaupt funktioniert, bevor es zusätzlich in einem „rational design“ Ansatz verbaut wurde.

Den Unterschied zwischen rational design und directed evolution habe ich bereits in einem früheren Substack ausführlich erklärt.

Um abzuschätzen, wie „sicher“ rationales Design in Proteinen ist, gibt es einen schönen Vergleich der von Englander[8] in seinem Paper illustriert, wie weit unser „Verständnis“ von Proteinfaltung ist:

„So kann man beispielsweise den Weg einer Multitonnen-Rakete durch 150 Millionen Meilen freien Raum bis zu einer punktgenauen Landung auf dem Mars berechnen. Die Gleichungen, die die Raumfahrt bestimmen, sind genau bekannt, die Computerleistung ist ausreichend, und die zu kontrollierende Strecke ist klar. Die Berechnung der strukturellen Reise winziger Proteinmoleküle durch die Submikrometer des Faltungsraums hat sich als schwieriger erwiesen.“ – Die erste Marslandung scheiterte an einem Rechenfehler…[9]

Das wäre mittels einer Biacore[10] Messung sehr einfach gewesen. Physikalisch nennt man eine Biacoremessung (benannt, nach der Firma, die das entwickelt hat, damals in den 1990er Jahren[11]) auch Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie. In Teil 5 werde ich darauf eingehen, welche Messungen ich durchgeführt hätte. Es ist in diesem Zusammenhang nicht wichtig, zu verstehen, wie Biocore funktioniert. Es reicht, zu verstehen, dass es eine über 20 Jahre etablierte Messmethode gegeben hätte, mit der man hätte überprüfen können, ob das modifizierte Spike bindet, wie stark es bindet, an welche Rezeptoren es sonst so bindet und ob man das modifizierte Protein wieder vom Rezeptor herunter bekommt, wenn es gebunden hat. Ja wenn man gewusst hätte, dass es eine solche Messmethode gibt und sie zum Einsatz gekommen wäre.

Es gibt aus den Pfizer eigenen Unterlagen aber durchaus vergleichbare Datensätze, die zwar ungenauer sind, aber eine Bilderbuch Bindungskurve des eigentlich nicht mehr bindungsfähigen Spike an ACE2 zeigen[12]:

Eigentlich soll das Schaubild zeigen, dass der vom Immunsystem nach der Impfung produzierte Antikörper an das Spike-Protein bindet (rechtes Bild). ABER ein in einer Präfusionskonfirmation geblocktes Spike-Protein hätte nicht an ACE2 Binden dürfen (linkes Bild) sondern ein flache Linie oder sehr niedriges Signal ergeben sollen. Man wusste also zumindest aus diesen Messwerten, dass das Prolin-Schloss nicht funktionierte, an ACE2 bindet und dann nicht mehr herunterzuspülen ist (sonst wäre das Signal gegen Ende wieder in Richtung Nulllinie abgefallen) und somit den Rezeptor blockiert. Welche Folgen eine solche dauerhafte Blockade nach sich ziehen würde hat man sich wohl nicht gefragt.

Letztendlich ist es aber egal, ob das Prolin-Schloss die gewünschte Funktion ausübt oder nicht, weil allein die Idee ein Prolin-Schloss zu verbauen, egal, ob es funktioniert oder nicht, im Desaster enden musste und zwar aus altbekannten Gründen, die ich nun erläutern werde.

Generell sind Proline in der Proteinfaltungsliteratur als, milde ausgedrückt, problematische Aminosäuren bekannt[13].

„Ein auffälliges, wiederkehrendes Merkmal des intermolekularen Aufbaus, das sowohl zum Domänenaustausch als auch zur Aggregation führt, sind Prolinreste. Es scheint, dass die Prolin-Isomerisierung der Schalter ist, der die Umwandlung zwischen monomeren und oligomeren Formen auslöst.“[14]

Das heißt im Klartext, Proline können dazu führen, dass Proteine Amyloide bilden. Amyloide sind krank machende Proteinaggregate, die man als Krankheitsbild in der Medizin als Amyloidose[15] kennt. Unter durch Proteinfehlfaltung verursachte Krankheiten fallen des Weiteren Alzheimer, Parkinson, Spongiforme Encephalitis, Diabetes Typ II. Die Menge des fehlgefalteten Proteins kann in einigen Organen durchaus den Kilogrammbereich erreichen[16].

Ein erfahrener Protein Engineer wird daher Proline meiden wie der Teufel das Weihwasser.

Die Natur weiß auch, dass Proline ein Problem darstellen, daher dienen Proline für Faltungshelferproteine (Chaperone) häufig als Erkennungssignal. Das wird sicherlich seinen Grund haben.

Als wäre das nicht schon genug Warnung, AUF KEINEN FALL PROLINE ZU VERBAUEN, ist aus der Literatur bekannt, dass der Einbau eines Prolins in das Hepatitis Spike Protein dieses neurotoxischer macht[17].

Und selbst wenn all das oben genannte kein Problem gewesen wäre und alles so geklappt hätte, wie man sich das ausgedacht hätte, wäre es trotzdem schief gegangen, weil man eine Kleinigkeit nicht bedacht hatte: eine Regel, die sich „Leben auf Messers Schneide der Löslichkeit (Life on the edge (of solubility)) nennt.

„Die Aufrechterhaltung des richtigen Gleichgewichts in den Populationen der verschiedenen Zustände von Proteinen ist von großer Bedeutung, da selbst geringfügige Veränderungen in diesen Populationen langfristig zu Krankheiten führen können.“[18]

Ich habe einen derartigen Gleichgewichtseffekt in meiner Promotion tatsächlich selbst erlebt, damals aber nicht verstanden, was es damit auf sich hatte. Das wurde mir tatsächlich erst klar, als ich mich für diese Reihe vertieft noch einmal in die aktuelle Literatur eingelesen habe.

Ich hatte in m einer Promotion[19] ein seltsames Phänomen, wenn ich mein Protein nach Größe sortiert noch einmal mit einer Sephadex 200 Säule gereinigt habe. Mein trimeres Protein ergab 3 Peaks, obwohl es bereits sauber war. Ich wollte es über diese Säule eigentlich nur umpuffern.

Wenn ich einen dieser drei Peaks noch einmal über die Säule schickte, spaltete sich das Protein erneut in diese drei Peaks auf: Trimer, Hexamer, Nonamer. Es gab also, aus einem mir unbekannten Grund, ein dynamisches, stabiles, sich immer wieder einstellendes Gleichgewicht zwischen diesen drei Formen.

Wenn also das Prolin-Schloss theoretisch wirklich funktioniert hätte, wäre dadurch das sich immer wieder einstellende Gleichgewicht zwischen den diversen Konformationen des Spike Proteins ohnehin durcheinandergekommen und hätte zu einem Problem geführt. Möglicherweise wären dann die Prä-Fusions-Proteine aggregiert, weil es von ihnen zu viele gegeben hätte im Verhältnis zu den anderen Konformationen?

Vielleicht ist die Antwort aber auch deutlich einfacher und die gleiche wie in meiner Promotion:

Das Spike zeigt anscheinend ein ähnliches Verhalten wie mein trimeres Protein aus meiner Doktorarbeit:

Es bildet Trimere, Hexamere und Nonamere [21], was man meines Wissens nicht ansatzweise in Betracht gezogen hat. Welchen Einfluss diese Verhalten auf die Immunreaktion haben könnte, auch bei hybriden Spike Proteinen bei Kreuzschlumpfung, kann ich nicht ansatzweise abschätzen, zumal das Spike-Protein auch noch an Polysorbat 80 bindet und dann Virusähnliche Partikel bildet. DAS hat aber nichts mit den Prolinen zu tun aber mit dynamischen Gleichgewichten, denn möglicherweise stehen auch in diesem Fall die Trimere, Hexamere und Nonamere in Lösung in einem bestimmten, fixten Gleichgewicht? Vielleicht ist es aber auch nur eine normale Wahrscheinlichkeitsverteilung, dass Trimere am wahrscheinlichsten sind, dann Hexamere und dann Nonamere und das einfach an der Konzentration der Proteine in Lösung liegt.

Erschwerend kommt zu alldem noch hinzu, dass man durch die in Teil 1 erwähnte Codonoptimierung, die Proteinmenge erhöhen und so optimieren wollte, weil man wohl dachte „viel hilft viel“.

Was man dabei nicht bedacht hat ist, dass Proteine in hohen Konzentrationen thermodynamisch instabil sind und daher zur Aggregation neigen. Es gibt daher einen evolutionären Druck, die Konzentration eines Proteins so zu optimieren, dass es löslich bleibt und eine gewisse Konzentration nicht überschreitet. Je niedriger die Konzentration, desto stabiler. Proteine sind daher von Natur aus genau so stabil, dass sie in den Konzentrationen, in welcher sie benötigt werden, vorliegen[20]. Stabilität und Konzentration hängen somit voneinander ab und beeinflussen sich möglicherweise.

Das Bild oben zeigt die Korrelation zwischen In-vivo-mRNA-Expressionsniveaus und In-vitro-Proteinaggregationsraten für eine Reihe von 11 menschlichen Proteinen, die entweder mit Krankheiten in Verbindung (rot) oder nicht in Verbindung (blau) stehen.

Hier hätten wir auch die Verbindung zwischen mRNA-Ablesegeschwindigkeit und Ablesemenge bzw. der potentiellen Langlebigkeit der modRNA zur Proteinkonzentration und den damit potentiell einhergehenden Löslichkeitsproblemen. Und das zusätzlich zur Stabilitätsveränderung durch das Prolin-Schloss.

Vendruscolo M sagt in seiner Publikation sehr klar und eindeutig:

Es wurde „gezeigt, dass die Grenze der "sicheren" Konzentration von Proteinen in lebenden Systemen erreicht ist, wenn die Stabilität des alternativen Aggregatzustands mit der des nativen Zustands vergleichbar ist. Es ist daher von großer Bedeutung, die gut etablierte Charakterisierung der Struktur, Faltung und Stabilität nativer Zustände durch eine ähnliche Analyse der Struktur, des Aufbaus und der Stabilität anderer Zustände zu ergänzen - von ungefalteten und teilweise gefalteten Spezies, einschließlich nativ ungefalteter Zustände, bis hin zu aggregierten Spezies wie Amyloidfibrillen.“

Wurden diese Charakterisierungen des Prä-Fusions-Spikes im Vergleich zum natürlichen Spike Protein durchgeführt?

Wurden überhaupt die Verhältnisse der verschiedenen Spike-Konformationen in Lösung bestimmt?

Wurden diese Charakterisierungen des Spikes mit den zwei zusätzlichen Prolinen und ohne Proline, also im natürlichen Zustand, im Vergleich durchgeführt?

War man sich des Problems überhaupt bewusst?!

Um das Problem zu erfassen, hätte es gereicht, vier einfach verständliche, 10 bis 20 Jahre alte, Übersichtsartikel zu lesen:

Englander SW, Mayne L. The nature of protein folding pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Nov 11;111(45):15873-80. doi: 10.1073/pnas.1411798111. Epub 2014 Oct 17. PMID: 25326421; PMCID: PMC4234557. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25326421/

Tsytlonok, M., & Itzhaki, L. S. (2013). The how’s and why’s of protein folding intermediates. Archives of Biochemistry and Biophysics, 531(1–2), 14–23. https://doi.org/10.1016/j.abb.2012.10.006

Dobson CM. Protein folding and misfolding. Nature. 2003 Dec 18;426(6968):884-90. doi: 10.1038/nature02261. PMID: 14685248. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14685248/

Vendruscolo M, Knowles TP, Dobson CM. Protein solubility and protein homeostasis: a generic view of protein misfolding disorders. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec 1;3(12):a010454. doi: 10.1101/cshperspect.a010454. PMID: 21825020; PMCID: PMC3225949. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21825020/

[1] Cross, R. (2020, September 29). https://cen.acs.org/pharmaceuticals/vaccines/tiny-tweak-behind-COVID-19/98/i38. C&En. Retrieved February 19, 2023, from https://cen.acs.org/pharmaceuticals/vaccines/tiny-tweak-behind-COVID-19/98/i38

[2] Pallesen J, Wang N, Corbett KS, Wrapp D, Kirchdoerfer RN, Turner HL, Cottrell CA, Becker MM, Wang L, Shi W, Kong WP, Andres EL, Kettenbach AN, Denison MR, Chappell JD, Graham BS, Ward AB, McLellan JS. Immunogenicity and structures of a rationally designed prefusion MERS-CoV spike antigen. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Aug 29;114(35):E7348-E7357. doi: 10.1073/pnas.1707304114. Epub 2017 Aug 14. PMID: 28807998; PMCID: PMC5584442.

[3] Ogata AF, Cheng CA, Desjardins M, Senussi Y, Sherman AC, Powell M, Novack L, Von S, Li X, Baden LR, Walt DR. Circulating Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) Vaccine Antigen Detected in the Plasma of mRNA-1273 Vaccine Recipients. Clin Infect Dis. 2022 Mar 1;74(4):715-718. doi: 10.1093/cid/ciab465. PMID: 34015087; PMCID: PMC8241425.

[4] Lu M, Chamblee M, Zhang Y, Ye C, Dravid P, Park JG, Mahesh KC, Trivedi S, Murthy S, Sharma H, Cassady C, Chaiwatpongsakorn S, Liang X, Yount JS, Boyaka PN, Peeples ME, Martinez-Sobrido L, Kapoor A, Li J. SARS-CoV-2 prefusion spike protein stabilized by six rather than two prolines is more potent for inducing antibodies that neutralize viral variants of concern. Proc Natl Acad Sci U S A. 2022 Aug 30;119(35):e2110105119. doi: 10.1073/pnas.2110105119. Epub 2022 Aug 22. PMID: 35994646; PMCID: PMC9436349.

[5] Graham, B. (2016, October 25). US10960070B2 - Prefusion coronavirus spike proteins and their use          - Google Patents. https://patents.google.com/patent/US10960070B2/en

[6] Hildt, E. (2022). Übersicht über die in der EU zugelassenen COVID-19-Impfstoffe – von der Technologie über die klinische Prüfung zur Zulassung. Bundesgesundheitsblatt - Gesundheitsforschung - Gesundheitsschutz, 65(12), 1237–1243. https://doi.org/10.1007/s00103-022-03600-4 https://link.springer.com/article/10.1007/s00103-022-03600-4

[7] https://d18rn0p25nwr6d.cloudfront.net/CIK-0001682852/72a717be-931e-4d92-bd4e-e7ad4652a97d.pdf

[8] Englander SW, Mayne L. The nature of protein folding pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Nov 11;111(45):15873-80. doi: 10.1073/pnas.1411798111. Epub 2014 Oct 17. PMID: 25326421; PMCID: PMC4234557. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25326421/

[9] Spiegel, D. (1999, October 1). a-e4547083-0001-0001-0000-000000044777. DER SPIEGEL, Hamburg, Germany. https://www.spiegel.de/wissenschaft/mensch/mars-climate-orbiter-absturz-wegen-leichtsinnsfehler-beim-rechnen-a-44777.html

[10] Cytiva. (n.d.). Biacore. https://www.cytivalifesciences.com/en/us/about-us/our-brands/biacore

[11] Wikipedia contributors. (2021, May 10). Biacore. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Biacore

[12] https://phmpt.org/wp-content/uploads/2023/02/125742_S1_M4_4.2.1-vr-vtr-10741.pdf Seite 10

[13] Wedemeyer WJ, Welker E, Scheraga HA. Proline cis-trans isomerization and protein folding. Biochemistry. 2002 Dec 17;41(50):14637-44. doi: 10.1021/bi020574b. PMID: 12475212. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12475212/

[14] Tsytlonok, M., & Itzhaki, L. S. (2013). The how’s and why’s of protein folding intermediates. Archives of Biochemistry and Biophysics, 531(1–2), 14–23. https://doi.org/10.1016/j.abb.2012.10.006

[15] Wikipedia-Autoren. (2004d). Amyloidose. de.wikipedia.org. https://de.wikipedia.org/wiki/Amyloidose

[16] Dobson CM. Protein folding and misfolding. Nature. 2003 Dec 18;426(6968):884-90. doi: 10.1038/nature02261. PMID: 14685248. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/14685248/

[17]Singh M, Kishore A, Maity D, Sunanda P, Krishnarjuna B, Vappala S, Raghothama S, Kenyon LC, Pal D, Das Sarma J. A proline insertion-deletion in the spike glycoprotein fusion peptide of mouse hepatitis virus strongly alters neuropathology. J Biol Chem. 2019 May 17;294(20):8064-8087. doi: 10.1074/jbc.RA118.004418. Epub 2019 Mar 1. PMID: 30824541; PMCID: PMC6527167. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30824541/

[18] Vendruscolo M, Knowles TP, Dobson CM. Protein solubility and protein homeostasis: a generic view of protein misfolding disorders. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec 1;3(12):a010454. doi: 10.1101/cshperspect.a010454. PMID: 21825020; PMCID: PMC3225949. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21825020/

[19] FreiDok plus - Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling And Mutational studies on chloramphenicol actetyltransferase I (CATI). (n.d.). https://freidok.uni-freiburg.de/data/11610

[20] Vendruscolo M, Knowles TP, Dobson CM. Protein solubility and protein homeostasis: a generic view of protein misfolding disorders. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2011 Dec 1;3(12):a010454. doi: 10.1101/cshperspect.a010454. PMID: 21825020; PMCID: PMC3225949. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21825020/

[21] Bangaru S, Ozorowski G, Turner HL, Antanasijevic A, Huang D, Wang X, Torres JL, Diedrich JK, Tian JH, Portnoff AD, Patel N, Massare MJ, Yates JR 3rd, Nemazee D, Paulson JC, Glenn G, Smith G, Ward AB. Structural analysis of full-length SARS-CoV-2 spike protein from an advanced vaccine candidate. Science. 2020 Nov 27;370(6520):1089-1094. doi: 10.1126/science.abe1502. Epub 2020 Oct 20. PMID: 33082295; PMCID: PMC7857404. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33082295/

Proteinfaltung ist ein mittlerweile über 60 Jahre alter Forschungsbereich in der Biochemie. Seit über 60 Jahren versucht man also halbwegs zu verstehen, warum und wie Proteine falten und hat gerade einmal die absolut grundlegenden Prinzipen halbwegs verstanden. In der Fachliteratur schreibt man das natürlich nicht so direkt hinein, sondern man umschreibt es blumiger, euphemistischer als:

„Das Problem der Proteinfaltung fasziniert Experimentatoren und Theoretiker gleichermaßen.“ Bzw. „Das Verständnis von Proteinen auf dieser grundlegenden Ebene bietet nicht nur viele intellektuelle Anreize, sondern hilft uns auch, die Mechanismen zu verstehen, die einer normalen Proteinfunktion oder einer Fehlfunktion von Proteinen zugrunde liegen.“ [1]

Diese zwei Zitate zeigen bereits, wie „mutig“ oder vielleicht wie wahnsinnig es ist, so ein Proteinfaltungsproblem in einem vielzelligen Organismus anzugehen, der verschiedene Organsysteme besitzt, deren Proteinproduktion sich von Zelltyp zu Zelltyp auch noch unterscheiden kann.

Es gibt einige grundlegende Prinzipien, die man als Protein Ingenieur kennen sollte, wenn man sich daran wagen sollte, ein Protein zu verändern. Genau wie ein normaler Ingenieur gewisse materialwissenschaftliche Grundlagen in seinem Studium erlernt und verstanden haben sollte. Man muss die Werkstoffe, mit denen man arbeitet verstehen, um ihre Belastungsgrenzen einhalten zu können, damit das Gebäude einem nicht plötzlich und unerwartet zusammenbricht. In der Architektur gibt es dafür den Fachbereich der Statik, in anderen Ingenieurswissenschaften die jeweiligen dazugehörigen Materialwissenschaften.

Proteine sind Bausteine und somit Baumaterialien, mit denen durch Corona-Impfungen in einer ausgelagerten Produktionseinheit (Mensch/menschliche Zellen), die Spike-Proteine (das Endprodukt) hergestellt wurde. Man könnte sagen, die Pharmaindustrie hat die Produktionskosten für ihr Produkt an den Konsumenten ausgelagert. Der Konsument ist somit der Produzent und trägt in deren verquerer Logik somit möglicherweise sogar die Verantwortung für das Endprodukt.

Das Material Protein unterliegt somit einigen materiell bedingten Einschränkungen, die man kennen muss, bevor man damit arbeitet, will man nicht, dass es spektakulär schief geht.

Ich werde hier nur die Materialeigenschaften auflisten, welche für das aktuelle Problem zum Verständnis des in diesem Kapitel behandelten Problems notwendig sind. Diese Informationen sind sehr einfach und ohne große Mühe, in entsprechenden, teils sogar schon recht alten Übersichtsartikeln zu finden[2]. Es handelt sich hier um einige in der Literatur als „common sense principles“ bezeichneten Grundsätze.

Das Thema Proteinfaltung wurde bereits in Teil 1 der Reihe behandelt. Das in Kapitel 1 erworbene Grundwissen wird in diesem Kapitel somit vorausgesetzt.

1.      Es gibt viele Belege, dass die teilweise Entfaltung von Proteinen über Zwischenstufen und Zwischenzustände eine wichtige Rolle bei der Regulierung biologischer Funktionen hat. Fehlfunktionen bei diesen (Ent-)Faltungsschritten führen zu Störungen im Organismus bis hin zu Krankheiten.

2.      Mutationen in Proteinen neigen zur Destabilisierung sowohl der Zwischenstufen als auch des Ursprungszustandes von Proteinen. Regionen mit geringer Stabilität können somit über die Anreicherung von teilweise entfalteten Zwischenprodukten zur Fehlfaltung von Proteinen und damit zu Aggregation und Krankheit führen.

3.      Proteine sind dynamische Moleküle, die Bewegungen gegenüber dem nativen Zustand ausführen müssen, um funktionieren zu können. Zwischenzustände sind das Ergebnis großräumiger Bewegungen und können daher Aufschluss die der biologischen Funktion zugrunde liegenden Mechanismen aufklären.

4.      Viele Krankheiten entstehen durch Funktionsverlust von Proteinen, der durch Mutationen verursacht wird, die eine Bindungsstelle oder aktive Stelle eines Proteins stören, oder durch erhöhte Expressionswerte (Produktionsraten), die zu einer erhöhten Aktivität eines Proteins führen. Alternativ können Mutationen jedoch auch Krankheiten verursachen durch Destabilisierung der nativen Struktur oder Stabilisierung nicht-nativer Konformationen, was zu einer Anreicherung von teilweise gefalteten Zwischenprodukten führt und somit zu Aggregation der betroffenen Proteine.

5.      Größere Proteine (wie das Spike-Protein), deren Faltung weniger kooperativ (störanfälliger und anspruchsvoller) ist, sind stärker gefährdet zu aggregieren oder fehlzufalten.

Diese 5 Prinzipien sagen in kürze vor allem eines:

Mutationen in einem Protein haben eine extrem hohe Wahrscheinlichkeit, dass das über jahrmillionen evolutionär optimierte Gleichgewicht zwischen verschiedenen Proteinkonformationen, sei es während der Faltung oder während seiner biologischen Aktivität, irreparabel zerstört wird und dies somit zu Krankheit führt. Die Wahrscheinlichkeit, dass eine Mutation für das Protein und somit für den Organismus von Vorteil gereicht, ist vorhanden, aber eher gering. Möglicherweise geringer als ein Sechser im Lotto mit Zusatzzahl.

Ich habe während meiner Promotion mit den 3D Strukturen(1NCO:B[3], 1Q23[4], 1PD5[5]), aus der Proteindatenbank gearbeitet, um mir irgendwelche kruden Ideen aus den Fingern zu saugen, warum mein Protein nun stabiler sein könnte. Ich habe selbst nicht an meine Hypothesen geglaubt, hatte aber nichts Besseres anzubieten und es klang eigentlich ganz intelligent. Mehr Wasserstoffbrücken, bessere hydrophobe Packung, minimale Strukturoptimierung, die üblichen Allgemeinplätze in diesem Fachbereich. Ich bin selbst überrascht, was ich damals so geschrieben habe.

Woher stammte diese 3D Proteinstruktur eigentlich, mit welcher ich mittels des swiss pdb viewers[6] bis auf Atomebene reinzoomen konnte?

Man hatte Kristalle gezüchtet. Diese Kristalle hat man dann mittels Röntgenstrukturanalyse[7] untersucht und aus dem Beugungsmuster auf die Struktur geschlossen. Ein sehr klassisches Verfahren aus den frühen 1950er Jahren, mit dem man auch die Struktur der DNA-Doppelhelix bestimmt hat. Das war die Geschichte mit dem von Watson und Crick gestohlenen Röntgenfilm von Rosalind Franklin, da gibt es sogar ein Theaterstück dazu und ein gängiger Witz in der Genetik war: „Was haben Watson und Crick entdeckt? – Das Röntgenbild von Rosalind Franklin.[8]“

Röntgenstrukturanalsye von Proteinen ist also zu meiner Zeit der gängige Goldstandard gewesen, den ich auch für das Spike Protein erwartet hätte.

Als ich mich aber in der Proteindatenbank auf die Suche machte und erst einmal routinemäßig nur Röntgenstrukturen wollte, bekam ich genau 0 Treffer. 0 Treffer!!!

Nicht einmal Ralph Baric (der mit den Feldermausviren und gain-of-funktion Experimenten in Wuhan) hatte für seine Spike Proteinstrukturen ordentliche Kristalle gezüchtet. Sogar er hat sogenannte Cryo-Elektronenmikriskopie (Cryo-EM) gemacht.

Warum hat man Cryo-EM gemacht und nicht einfach klassisch Kristalle gezüchtet? Diese Frage hätte man sich zu beginn der Planung des Impf-Spikes einfach mal vorsichtshalber stellen sollen und in einen entsprechenden Übersichtsartikel schauen sollen, der es einem erklärt[9]:

„Leider lassen sich Membranproteine bekanntermaßen nur schwer zu geordneten Kristallen züchten, da sie […]  flexibel sind und keine hydrophilen (wasserliebenden) Bereiche aufweisen […].“

Flexible Proteine sind also ein Problem bei der Kristallzucht. Wenn ein großes Protein sich also nicht kristallisieren lassen will, sollte man daran denken, dass es sich möglicherweise um ein sehr flexibles Protein handeln könnte.

Das wäre der Augenblick, bei dem alle Warnlampen eingehen sollten, wenn man sich an die oben benannten grundlegenden Prinzipien erinnert.

Flexible Proteine sind ähnlich wie Maschinen mit vielen beweglichen Teilen und Zahnrädern, die optimal miteinander intergieren müssen, damit die Maschine funktioniert. Ist eines der beweglichen Teile durch Mutation gestört, kann das die Maschine zerstören, wie ein festgefressener Kolben einen Motor. Ist die Struktur der Maschine durch Mutation und die daraus resultierenden sogenannten Langstreckeneinflüsse verzogen, ist das wie ein verzogener Rahmen eines Unfallwagens unter Umständen ein langfristig ernsthaftes Problem, welches in diesem Fall zu Krankheit führen kann.

Pfizer/BioNTech verweisen in ihren Unterlagen an die FDA und EMA übrigens auf Cryo-EM Daten. Veröffentlich wurden diese referenzierten Daten aber erst im Februar 2020[10]. An dieser Stelle frage ich mich schon, mit welcher Proteinstrukturdatei wurde beim angeblich zum Einsatz gekommenen rational Design und Planung des Impf-Spike im Januar 2020 eigentlich gearbeitet, wenn es noch keine Struktur gab, mit der man arbeiten konnte?

Cryo-EM ist, aus meiner Sicht aus mehreren Gründen problematisch, um die Struktur eines Proteins zu bestimmen. In normalem wissenschaftlichen Umfeld sicherlich kein großes Problem und durchaus OK. Wenn man jedoch ein neues, körperfremdes Eiweiß in einem Menschen produziert, wäre mir Cryo-EM viel zu ungenau.

Man arbeitet mit vielen, vielen unscharfen Elektronenmikroskopischen Fotos des Proteins und rechnet diese zu einem Modell indem man diverse Algorithmen über dieses Model schickt und damit eine Struktur herbeirechnet.

Davon abgesehen, dass man nicht unbedingt alle Blickwinkel des Proteins fotografiert bekommt, weil das Protein eine bestimmte Liegeposition bevorzugt, sind die verwendeten Algorithmen natürlich mit einem potentiellen BIAS behaftet. Es kann nur ein näherungsweises Bild der Realität erzeugt werden. Das liest sich dann sehr klugscheißerisch in den Pfizer Unterlagen wie folgt:

“Das Atommodell aus PDB ID 6XR8 (Cai et al., 2020) wurde starr in die Dichtekarte eingepasst, dann flexibel mittels Phenix unter Verwendung von Realraumverfeinerung abwechselnd mit manueller Modellierung mit Coot angepasst. Die Statistiken zur Datenerfassung, 3D-Rekonstruktion und Modellverfeinerung sind in Tabelle 1 aufgeführt” (The atomic model from PDB ID 6XR8 (Cai et al, 2020) was rigid-body fitted into the map density, then flexibly fitted to the density using real-space refinement in Phenix (Adams et al, 2010) alternating with manual building in Coot (Emsley et al, 2010). Data collection, 3D reconstruction and model refinement statistics are listed in Table 1.)[11]

Im Klartext: Wir haben und die schönsten unscharfen elektronenmikroskopischen Fotos genommen, dann ein anderes Modell namens 6XR8[12] von einer anderen Forschergruppe aus der pdb Datenbank genommen, welches erst am 11.7.2020 in die Proteindatenbank hochgeladen wurde, und darüber haben wir dann abwechselnd verschiedene Modellierungsprogramme laufen lassen und ein wenig von Hand nachgebessert, bis uns das Modell in den Kram passte.

So traurig ich auch bin euch diese Nachricht überbringen zu müssen:

KEINER WEISS AKTUELL WIE DAS SPIKE-PROTEIN AUSSIEHT!

Pfizer wusste es zum Zeitpunkt der Impfstoffherstellung erst recht nicht.

Das Bild, welches wir vom Spike haben ist wie ein Dürer Stich eines Nashorns.

Zum Vergleich ein Foto eines Nashorns. Die Unterschiede sind offensichtlich:

Man erkennt bei Dürer, dass es sich um ein Nashorn handeln muss, damit endet die biologische Verwertbarkeit des Bildes aber auch.

Es gibt mittlerweile eine Publikation, welche die diversen Cryo-EM Strukturen, die erzeugt wurden, auf einen Nenner zu bringen versucht[13]. Diese Publikation enthält einige bemerkenswerte Feststellungen:

1.      Es handelt sich beim Spike-Protein um ein hochflexibles Protein mit mobilen Bestandteilen. – Es ist somit klar, dass es sich um eine sehr empfindliche Maschinerie mit vielen mobilen Teilen handelt, die fein aufeinander abgestimmt agieren müssen und die höchstwahrscheinlich evolutionär sehr fein aufeinander abgestimmt sind.

2.      Trotz einer allgemeinen Ähnlichkeit der Organisation der Untereinheiten wurden bei den verschiedenen in der Datenbank hinterlegten Strukturen festgestellt, dass S-Proteine unterschiedliche Konfigurationen aufweisen. – Es gibt sehr viele Cryo-EM Strukturen und die kommen alle irgendwie zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen. Woher will BioNTech/Pfizer dann wissen, ob ihre Struktur richtig oder näher an der Wahrheit ist?

3.      Obwohl diese Strukturen wesentliche Informationen zur Identifizierung der relativen Anordnung dieser Domänen geliefert haben, ist das Ausmaß, in dem die konformative Heterogenität durch Mutation während der natürlichen Evolution des Virus und im Zusammenhang mit der Entwicklung von Impfstoff-Immunogenen verändert wird, muss noch ermittelt werden. – Übersetzt heißt das: Wir haben keine Ahnung, was für Folgen Mutationen wie Prolin-Schloss oder Varianten Anpassung auf die Struktur des resultierenden Proteins haben. Das ist aber ein spannendes Forschungsthema für die Zukunft. Dumm nur, dass man das bereits im Versuch direkt im Menschen umgesetzt hat.

4.      Unsere Ergebnisse offenbaren eine heterogene Konformationslandschaft des SARS-CoV-2-Spike, die sehr anfällig für Veränderungen durch die Einführung von Mutationen an den Kontaktstellen zwischen den S1 und S2-Untereinheiten sind. – Zwischen S1 und S2 liegt die Furinschnittstelle, die von Moderna patentiert ist unter Patent Nummer US 9587003 B2[14] [15].

5.      Große Veränderungen in der S-Proteinstruktur können durch wenige Mutationen entstehen.- Fehlerhaftes ablesen durch das verwendete N1-Methylpseudouridin könnte ein echtes Problem sein. Das N1-Methylpseudouridinproblem wird aber separat behandelt.

Oder, um es mit einem Review zu sagen: fehlende Bereiche sind in weiß eingezeichnet:

[17]

Fazit zu Teil 2:

Man hat sich an eine sehr dynamische, molekulare Maschine gewagt, deren Bauplan man im Detail nicht kennt, aber von außen grob abschätzen zu können glaubt, wie die Maschine innen aussieht.

Man hat Milliarden von Menschen ein Protein durch ihre eigenen Köperzellen bauen lassen, von dem man nicht weiß, wie es aussieht und nicht im Detail verstanden hat, wie es wirklich funktioniert. Zudem hat man dieses Protein noch durch die in Teil 1 bereits erklärte Codonoptimierung in Richtung Fehlfaltung getrieben, wofür große, flexibel-dynamische Proteine ganz besonders anfällig sind.

Einen einzigen, 10 Jahre alten, wissenschaftlichen Übersichtsartikel zu lesen, hätte vollkommen gereicht, das Problem zu erkennen Vielleicht wäre man dadurch zu der Erkenntnis gekommen, dass es eine saudumme Idee ist sich an ein großes, dynamisches, flexibles Protein heranzuwagen, dessen Struktur man nicht kennt und über dessen exakten Funktionsmechanismus aktuell noch spekuliert wird, während es von den behandelten Menschen in unbekannten Mengen hergestellt wird.

Tsytlonok M, Itzhaki LS. The how's and why's of protein folding intermediates. Arch Biochem Biophys. 2013 Mar;531(1-2):14-23. doi: 10.1016/j.abb.2012.10.006. Epub 2012 Oct 23. PMID: 23098780. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23098780/

OK, 2 Artikel:

García-Nafría J, Tate CG. Cryo-Electron Microscopy: Moving Beyond X-Ray Crystal Structures for Drug Receptors and Drug Development. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2020 Jan 6;60:51-71. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010919-023545. Epub 2019 Jul 26. PMID: 31348870. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31348870/

Mut? Wahnsinn? Hybris? Selbstüberschätzung? Bösartigkeit? Oder einfach nur grenzenlose Dummheit und Ignoranz?

Was sagt Ugur dazu in seinem Project Lightspeed?

"Es war keineswegs sicher, dass ein «künstliches» Spike-Protein, das im Labor losgelöst von übrigen Viruspartikeln, die es stabil halten, hergestellt wurde, jede mikroskopisch kleine Delle mit dem Spike eines Coronavirus teilen würde. Eine Abweichung um den Bruchteil einer Haaresbreite gefährdete diejenigen, die ihn erhalten. Uğur war sich dieses Risikos bewusst und suchte anhand der genetischen Sequenz und eines digitalen Modells des Virus, das er schnell erstellt hatte, nach präzisen Stellen in der Kette, an denen er das Protein «spleißen» konnte, wobei genügend der umgebenden Buchstaben – die Aminosäuren – erhalten blieben, um es zu stabilisieren, sodass es seine perfekte Form behielt (S. 48)."

Verstehe ich das richtig? Jemand, der keine Ahnung von Coronaviren hat, keine Ausbildung in Protein Engineering hat, weil er immer nur mit RNA gearbeitet hat, der grob weiß, dass das Ganze tückisch sein kann, schnippelt sich am Computer die Proteinsequenz raus und denkt "passt scho“.

Eine weitere Frage, die sich mir bei dieser Textstelle auch stellt: Ugur erstellt sich schnell ein Modell des Virus? Wie hat er das Spike-Protein anhand der Gensequenz modelliert?! Das ist laut der aktuellen Proteinfaltungsliteratur selbst mit deep learning Methoden noch nicht möglich[16].

Möglicherweise hat er ja basierend auf seinem Fernkurs Mathematik aus den 1980er Jahren ein über 60 Jahre altes Problem gelöst: Wie man anhand einer Gensequenz die 3D Struktur eines Proteins exakt und korrekt vorhersagt. Und das, ohne einen großen Rechencluster, der mehrere Tage am Stück durchrechnet. Nein, ganz alleine, daheim, am handelsüblichen Heim-PC.

Hat Ugur überhaupt eine Proteinstruktur, irgendeine Proteinstruktur aus der Proteindatenbank zu Rate gezogen?

Hatte er auch nur ansatzweise eine Ahnung, wie empfindlich die dynamischen Gleichgewichte zwischen verschiedenen Proteinkonformationen sind!?

Diese Fragen würde ich ihm gerne einmal stellen.

[1] Tsytlonok M, Itzhaki LS. The how's and why's of protein folding intermediates. Arch Biochem Biophys. 2013 Mar;531(1-2):14-23. doi: 10.1016/j.abb.2012.10.006. Epub 2012 Oct 23. PMID: 23098780. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23098780/

[2] Tsytlonok M, Itzhaki LS. The how's and why's of protein folding intermediates. Arch Biochem Biophys. 2013 Mar;531(1-2):14-23. doi: 10.1016/j.abb.2012.10.006. Epub 2012 Oct 23. PMID: 23098780. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23098780/

[3] Bank, R. P. D. (n.d.-a). RCSB PDB - 1NOC: Murine inducible Nitric oxide synthase Oxygenase domain (Delta 114) complexed with Type I E. coli chloramphenicol acetyl transferase and imidazole. https://www.rcsb.org/structure/1NOC

[4] Bank, R. P. D. (n.d.). RCSB PDB - 1Q23: Crystal structure of Chloramphenicol acetyltransferase I complexed with Fusidic acid at 2.18 A resolution. https://www.rcsb.org/structure/1Q23

[5] Bank, R. P. D. (n.d.-a). RCSB PDB - 1PD5: Crystal structure of E.coli chloramphenicol acetyltransferase type I at 2.5 Angstrom resolution. https://www.rcsb.org/structure/1PD5

[6] Swiss-PdBViewer: Download. (n.d.). http://www.genebee.msu.su/spdbv/text/getpc.htm

[7] Röntgenstrukturanalyse. (n.d.). Lexikon Der Chemie. https://www.spektrum.de/lexikon/chemie/roentgenstrukturanalyse/8031

[8] Wikipedia contributors. (2023d). Photo 51. Wikipedia. https://en.wikipedia.org/wiki/Photo_51

[9] García-Nafría J, Tate CG. Cryo-Electron Microscopy: Moving Beyond X-Ray Crystal Structures for Drug Receptors and Drug Development. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2020 Jan 6;60:51-71. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010919-023545. Epub 2019 Jul 26. PMID: 31348870. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31348870/

[10] Wrapp D, Wang N, Corbett KS, Goldsmith JA, Hsieh CL, Abiona O, Graham BS, McLellan JS. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 2020 Mar 13;367(6483):1260-1263. doi: 10.1126/science.abb2507. Epub 2020 Feb 19. PMID: 32075877; PMCID: PMC7164637.

[11] https://phmpt.org/wp-content/uploads/2023/02/125742_S1_M4_4.2.1-vr-vtr-10741.pdf Seite 7

[12] Bank, R. P. D. (n.d.-d). RCSB PDB - 6XR8: Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. https://www.rcsb.org/structure/6XR8

[13] Henderson R, Edwards RJ, Mansouri K, Janowska K, Stalls V, Gobeil SMC, Kopp M, Li D, Parks R, Hsu AL, Borgnia MJ, Haynes BF, Acharya P. Controlling the SARS-CoV-2 spike glycoprotein conformation. Nat Struct Mol Biol. 2020 Oct;27(10):925-933. doi: 10.1038/s41594-020-0479-4. Epub 2020 Jul 22. PMID: 32699321; PMCID: PMC8581954. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32699321/

[14] Boyd, C. (2022, March 3). Study finds genetic code in Covid’s spike protein linked to Moderna patent. Mail Online. https://www.dailymail.co.uk/news/article-10542309/Fresh-lab-leak-fears-study-finds-genetic-code-Covids-spike-protein-linked-Moderna-patent.html

[15] https://patents.google.com/patent/US9587003B2/en

[16] Jisna VA, Jayaraj PB. Protein Structure Prediction: Conventional and Deep Learning Perspectives. Protein J. 2021 Aug;40(4):522-544. doi: 10.1007/s10930-021-10003-y. Epub 2021 May 28. PMID: 34050498. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34050498/

[17] Parry, P.I.; Lefringhausen, A.; Turni, C.; Neil, C.J.; Cosford, R.; Hudson, N.J.; Gillespie, J. ‘Spikeopathy’: COVID-19 Spike Protein Is Pathogenic, from Both Virus and Vaccine mRNA. Biomedicines 2023, 11, 2287. https://doi.org/10.3390/biomedicines11082287

Übersichtsartikel werden auch als „Grauliteratur“ bezeichnet. Sie sind in gewisser Weise die „Unterhaltungsliteratur“ in der Wissenschaft, mit welcher man sich gemütlich und meist in einfacherer Sprache, einen soliden Überblich über ein Fachgebiet anlesen kann, ohne allzu viel Recherchearbeit investieren zu müssen. Reviews sind so eine Art Lektürehilfe/Lektüreschlüssel für Wissenschaft. Genau wie Schüler gerne nur die Lektürehilfe zu Faust lesen, statt das Theaterstück, lesen Wissenschaftler lieber Reviews statt vieler, vieler einzelner Paper, aus denen man sich dann die kleinen Puzzlestücke auch noch selbst zusammenstückeln muss und wie beim Theaterstück häufig auch noch zwischen den Zeilen lesen muss. Das ist beim Review von jemandem anderen für einen erledigt worden. 60 Jahre Forschung auf 10 Seiten, so macht das Spaß. Will man etwas genauer wissen, kann man in die Endnoten gehen und sich die Details genauer anschauen.

Arbeitet man auf einem eng beackerten Wissenschaftsfeld, gibt es viele schöne Reviews, aber auch viel Konkurrenz. Arbeitet man auf einem verwaisten Gebiet, kann es sein, dass man selbst der Depp ist, der das Review schreiben muss, weil man sich ja gerade so schön in die Literatur eingearbeitet hat und der Laborleiter (auch PI, primary investigator genannt) das eine gute Idee findet, wenn das mal einer wieder hübsch zusammenfasst. Das erwischt zugegebenermaßen normalerweise nicht den frischen Doktorenden, sondern den frischen, neuen Post-Doc (also jemand, der nach der Doktorarbeit in einer neuen Gruppe seine wissenschaftliche Arbeit 6 Jahre fortsetzt, um anschließend eine Habilitationsstelle zu suchen und den steinigen Weg zur Professur anzutreten) bzw. den Doktoranden in den letzten Zügen seiner Promotion. Wenn man ohnehin dabei ist zusammenzuschreiben, kann man auch direkt ein Review verfassen, man ist ja ohnehin gerade dabei.

Ich verlange von Ugur nichts anderes als das, was ich von einem frischen Doktoranden erwarten würde, wenn er sich in ein neues Themengebiet einarbeitet. Denn es war ja PANEMDIE!!! Wir werden alle sterben!!! Und Ugur war im Stress. Vielleicht hat er ja wirklich daran geglaubt, wer weiß. Für ein paar Reviews zum Thema Proteinoptimierung und Proteinfaltung hätte die Zeit aber definitiv gereicht. Dann hätte Ugur, sein Team oder vielleicht jemand bei Pfizer ein paar fatale und extrem peinliche Anfängerfehler vermeiden können.

Hier nun beginne ich mit einer kleinen Reihe über die Anfängerfehler im Proteindesign, die Ugur unterlaufen sind.

BioNTech/Pfizer und Moderna haben sich verhalten wie ein übermütiger, junger, betrunkener Autofahrer, der keinen Führerschein hat und daher die Straßenregeln nicht kennt (=Regeln des Proteindesigns), sein Auto nicht unter Kontrolle hat und mit 200kmh/h durch eine volle Fußgängerzone zur Haupteinkaufzeit am Samstag rast.

Einen solchen Autofahrer von seiner Schuld freizusprechen, weil er ja keinen Führerschein habe und die Regeln somit nicht kennen konnte, würde wohl kaum einem Beteiligten in den Sinn kommen.

Im Folgenden werde ich die „Verkehrsregeln“ beschreiben und erklären, die BioNTech/Pfizer und Moderna möglicherweise nicht kannten oder fahrlässig ignoriert haben, um sich anschließend in diversen Veröffentlichungen auch noch damit zu brüsten, dass sie eben genau diese Fehler begangen haben.

Ich werde jedem seiner Fehler einen eigenen Substack widmen, damit man sie jeweils einzeln in ihrer vollen Schönheit betrachten und würdigen kann. Teilweise passierten die Fehler schon auf einem sehr grundsätzlichen Niveau des Schülerdudens Biologie. Da ich aber davon ausgehe, dass Ugur keinen aktuelleren Schülerduden besitzt, werde ich mit Reviews von vor Corona argumentieren, die er hätte lesen können und auch lesen müssen, bevor er Hand an etwas gelegt hat, das weder er noch die Forscher, die auf diesem Gebiet seit Jahrzehnten arbeiten, verstanden haben. Wenn es die Experten nicht verstehen, dann lässt man als Laie einfach mal die Finger davon, wäre mein unqualifizierter Vorschlag in diesem Zusammenhang.

Wäre Ugur einer meiner Studenten gewesen, ich hätte ihn durch die Prüfung fallen lassen. Und dabei bewegen wir und hier „nur“ auf dem Gebiet der Codonoptimierung. Vom N1-Methylpseudouridin habe ich hier noch gar nicht angefangen, DAS ist auch so eine grenzdebile Schwachsinnsidee, der ich einen anderen Substack widmen werde. Ganz abgesehen davon, dass man die Finger von einem Protein lässt, dass ohnehin schon in einem labilen strukturellen Gleichgewicht ist und dann vor allem in so ein Protein keine Proline verbaut.

Aktuell sieht die Planung für diese Substack-Reihe wie folgt aus:

Teil 1: Warum es eine grenzdebil schwachsinnige Idee war, die Codons zu „optimieren“.

Teil 2: Warum es eine grenzdebil schwachsinnige Idee war, Proline zu verbauen.

Teil 3 Warum es eine grenzdebil schwachsinnige Idee war, ein strukturell dynamisches Protein überhaupt auch nur anzufassen, dessen Struktur man nicht einmal im Detail kennt.

Teil 4: Warum es eine grenzdebil schwachsinnige Idee war, N1-Methylpseudouridin zu verwenden.

Teil 5: Welche biochemischen Basisdaten des Spikes ich gerne hätte also meine persönliche Analysewunschliste

Wenn das jetzt einen irgendwie genervt, übellaunigen, angefressenen Eindruck macht, dann ist der Eindruck vollkommen korrekt. Ich habe nach der Recherche zu dieser debilen Schwachsinnsidee seitens Ugurs bereits 2 Tage schlechte Laune und muss die nun los werden.

Beginnen wir einmal damit, was Ugur selbst zum Optimierungsproblem in seinem Buch „Project Lightspeed“ geschrieben hat und was ich in meiner Reihe „Einmal mit Profis arbeiten“ bereits dazu angedeutet habe, ohne ins Detail zu gehen, das mache ich nämlich in dieser Reihe.

„Die Nukleotidsequenz für den knubbeligen Stachel war leicht (Hervorhebung von mir) verändert worden, um die Produktion durch die Körperzellen zu optimieren. Der Impfstoff mit der Bezeichnung BNT162b2.9 war gerade erst an Mäusen getestet worden, und Blutproben der Nager waren an Muik geliefert worden. Die Ergebnisse waren eindeutig: Er hatte eine weitaus bessere Antikörperreaktion ausgelöst als das sehr ähnliche modRNA-Konstrukt BNT162b2.8, das bereits als Kandidat für die klinische Studie ausgewählt worden war.“ (Project Lightspeed, S. 233)

Interessant ist an diesem Zitat eigentlich nur ein einziges Wort „die Nukleotidsequenz leicht verändert wurde, um die Produktion durch die Körperzellen zu optimieren.“

Diese „leichte“ Veränderung kennt man seit einiger Zeit unter #COptiGate[1].

Vom Wissensstand, der hier vorausgesetzt wird, befinden wir uns im Duden Biologie Abiturwissen beim Thema Proteinbiosynthese bei Pro- und Eukaryoten[2]. Bei meinem Schülerduden von 2004 ist das auf Seite 208f, also nichts, was Ugur nicht hätte wissen können und müssen! Dieser Fehler passierte also nicht auf Mittelstufenniveau, sondern auf Oberstufenniveau, was schon ein gewisser Fortschritt ist. Man freut sich ja mittlerweile über jede kleine Anhebung des Niveaus, auf dem man argumentieren kann, 9. Klasse Immunbiologie wurde mit mittlerweile schon ein wenig langweilig. Auf zum Abitur!

Die DNA setzt sich aus den vier Nukleoiden A, T, G, C zusammen. A paart mit T und G paart mit C in einem DNA-Doppelstrang. Je 3 Nukleoide ergeben ein sogenanntes Triplet. Je nach Tripletzusammensetzung werden unterschiedliche Aminosäuren oder Stopps für die Proteinfabrik Ribosom kodiert.

Abbildung 1 Schülerduden Biologie (2004) S. 203 Genetischer Code

Dekodiert werden die Triplets mittels der Transport-tRNA, die für das Ribosom übersetzt, welche Aminosäure laut mRNA Bauplan als nächstes verbaut werden soll. Transport RNA deswegen, weil jede dieser tRNA-Moleküle eine Aminosäure mit sich schleppt und quasi zum Ribosom transportiert. An dieser Stelle kommt eigentlich noch das N1-Methylpseudouridinproblem hinzu, welches aus der vielfach vermarkteten mRNA die korrekter beschriebene modifiziert (mod)RNA in der Plörre macht. Das werde ich aber der Verständlichkeit halber als eigenen Artikel ausgliedern, weil es sonst zu komplex wird.

Manche Aminosäuren haben viele verschiedene Triplets, die für sie kodieren. Manche Aminosäuren nur wenige Triplets.

In der Schule lernt man, dass jeder Tripletcode hat seine eigene dekodierende tRNA hat. Die als Decoder fungierende tRNA kommt, je nach Tripletcode, in sehr unterschiedlichen Mengen vor. Manche tRNAs sind häufig, manche sind selten. Das variiert zudem noch von Organismus zu Organismus, was es nicht einfacher macht und daher bei einem Wechsel in einen anderen Organismus beachtet werden muss, sonst kann entweder das gewünschte Protein nicht gebildet werden oder im schlimmsten Fall bringt man diesen unter Umständen aus Versehen um. Das ist Grundwissen im genetischen Labor. Immer schön den Tripletcode an den produzierenden Organismus anpassen.

Leider ist das eine SEHR vereinfachte und leider auch falsche Darstellung.

Die Realität ist wieder einmal deutlich komplexer.

Nicht jedes Codon hat überhaupt eine tRNA. Es gibt Codons, die haben gar keine eigene tRNA und werden von anderen tRNAs mit bedient. Das variiert auch nocht von Organismus zu Organismus und von Organ zu Organ.

Rot markiert die Codons, die keine eigene tRNA haben und nur über sogenannte wobbel tRNA (also an einer Stelle rumwackelnde tRNA bedient) werden, andere Codons von tRNAs wo sowohl als auch zutrifft. Was passiert wohl, wenn da ein N1-Methylpseudouridin verbaut ist?!

(A critical analysis of codon optimization in human therapeutics - PubMed (nih.gov))

Nicht zum Grundwissen gehört des Weiteren, dass es zudem wohl deutlich mehr tRNAs gibt, als wir bisher dachten und diese wohl auch eine regulatorische Funktion haben könnten, die wir noch nicht verstehen[3]. Es handelt sich um die sogenannten tRNA Isodecoder über deren Funktion spekuliert wird.

„Das Überwiegen der tRNA-Isodecoder - die mehr als die Hälfte aller in höheren Säugetieren beobachteten tRNA-Gene ausmachen - war jedoch unerwartet und ihre funktionelle Bedeutung ist noch nicht geklärt“ (However, the preponderance of tRNA isodecoders – making up more than half of all tRNA genes observed in higher mammals – was unexpected and its functional importance is not yet understood.)[4]

Unerwartet, wer konnte es nur ahnen, dass da etwas unerwartet sein könnte? Wie sich diese Isodekoder wohl bei N1-Methylpseudouridin  verhalten? Aber das ist ja ein anderes Thema.

Richtig spannend wird es, wenn man bedacht hätte, was Ugur – immerhin ordentlicher Professor und Arbeitsgruppenleiter am Institut für Immunologie der Universität Mainz-  aus unerklärlichen Gründen nicht getan hat, dass tRNAs möglicherweise auch noch gewebespezifisch in unterschiedlichen Konzentrationen vorhanden sein könnten, wie man das von der Seidenraupe seit 1979 weiß[5]. Hat man für den Menschen leider nicht so genau untersucht, also gar nicht. Man konnte aber beobachten, dass das Spike-Proteine, je nach Zellkultur (also ein gewisser Hinweis auf eine mögliche Organspezifität) in unterschiedlicher Menge an der Zelloberfläche exprimiert wird, während andere Zelllinien wiederum das Spike-Protein bevorzugt als freies Spike-Protein freisetzen (sezernieren)[6] [7]. Die Variation kann natürlich sowohl von den komplett unterschiedlichen Organen stammen, von denen die Zellkulturen abgeleitet sind als auch, dass es sich um Zellkulturen von unterschiedlichen Menschen handelt. Aber auch das, wäre ein Warnsignal, dass wir nichts verstanden haben, nicht ansatzweise, was bei der Proteinproduktion in den verschiedenen Zelltypen passiert.

Was hat Ugur gemacht? Er will von den Körperzellen schnell und viel Protein herstellen lassen und arbeitet ERNEUT nach dem Motto viel hilft viel. «Da wir nicht wissen, was nötig ist, sollten wir beim Maximum anfangen», hatte Ugur erklärt.“ (Projekt Lightspeed, S. 220).

So einfach, wie es im Biologiebuch steht ist es dann wohl nicht in der biologischen Realität. Aber selbst das Schulbuchwissen hätte eigentlich schon als Warnung reichen müssen, würde man annehmen.

Hier müssen wir auf das Thema Proteinfaltung eingehen: am Ribosom entsteht zuerst einmal nur eine lange Aneinanderreihung von Aminosäuren – abhängig von der Sequenzen und den Triplets der TRNAs werden diese aneinander gebastelt. Dann aber muss sich das eigentliche funktionelle Protein bilden – manche werden zu kugeln, andere zu langen fasern usw. das ist ein sehr komplexer Vorgang, fast wie Origami. Und wie bei Origami beeinflusst die Sorgfalt und Geschwindigkeit mit der gefaltet wird, auch wie genau hinterher alles ordentlich da landet, wo es soll und der Kopf des Kranichs landet a auch wirklich an der Kopfposition und nicht am Hintern, bzw. dass man überhaupt erkennt, was es eigentlich einmal werden sollte.

Und das, ist nur ein gaaaaaaaaaaaaanz einfaches Origami. Es gibt es noch ganz andere Kaliber wie Origami Samurais:

Genauso unterschiedlich schwierig wie ein Kranich im Vergleich zu einem Origami Samurai ist es auch bei den Proteinen mit dem Falten. Es gibt kleine Kranich-Proteine, die schnell und spontan falten und dann eben Samurai-Proteine. Die sind ein klein wenig komplexer. Einen Origamikranich kann man mit Kindern falten, einen Samurai eher nicht. Das Spike Protein ist ein Samurai.

Abbildung 2 Schülerduden Biologie (2004) S. 210 Translation und das allosterische Dreistellenmodell

Hat man einen Tripletcode verbaut, der eine seltene tRNA zur Dekodierung braucht, wird die Produktion des Eiweißes langsamer, weil der Nachschub an tRNA nicht so schnell fließt[8]. Das ist wie beim Legobasteln: die häufigen Bausteine kann man viel schneller zusammenstecken, also wenn man in der Wühlkiste ewig nach dem einen seltenen Teil suchen muss.

Das beeinflusst MASSIV die Faltung eines Eiweißes und ist von der Natur extra so konzipiert, damit ein Eiweiß an kniffligen Stellen Zeit hat, richtig zu falten.

Oder um aus dem Waudby Review zu zitieren: „Erstens wird die Translationsrate durch die Zeit für das Auffinden und die Dekodierung verwandter tRNA-Moleküle begrenzt, die wiederum von den jeweiligen tRNA-Konzentrationen sowie von der Konkurrenz mit verwandten tRNAs und synonymen Mutationen zwischen reichlich vorhandenen und seltenen tRNAs abhängt; es wurde beobachtet, dass diese Veränderungen die Translationsrate um Größenordnungen beeinflussen.“

Man lasse sich das Wort um GRÖSSENORDNUNGEN[9] [10] mal auf der Zunge zergehen.

Abbildung 3 Schülerduden Biologie (2004) S. 211 Regulation der Genaktivität

Wenn man sich das Bild aus dem Schülerduden mal genau anschaut, steht da bereits etwas von langsam? Schnell? Genau das Problem, das ich bereits beschrieben habe, oder um es wissenschaftlich niveauvoller zu belegen, als mit einem alten Schülerduden aus dem Jahr 2004:

Es gibt aktuell eine beliebte Theorie, wie Protein falten: Die Energielandschaft. Entlang dieser Energielandschaft faltet das Protein energetisch bergab und sucht sich so seinen Weg ins energetische Tal der optimalen Faltung. Der Weg hinab ins Tal wird räumlich dadurch eingeschränkt, dass das Protein bereits zu falten beginnt, während es aus dem Ribosom hinten herauskommt. Da ein Teil der Aminosäurekette noch im Ribosom steckt, bzw. noch gar nicht hergestellt wurde, kann nur das falten, was hinten aus dem Ribosom baumelt. Das Ribosom selbst hilft wohl auch noch bei der Faltung mit, mit irgendwelchen äußeren Strukturen (die man, Überraschung!, noch nicht verstanden hat). Da es also prinzipiell schon mal einige statisch, räumliche Einschränkungen bei der Faltung gibt, kann das Protein bei der Faltung nicht die kompletten Möglichkeiten dieser Energielandschaft nutzen[11].

Das klingt auf den ersten Blick schön gelehrt und als wenn man Ahnung hätte von was man da redet. Schaut man ins Detail, stellt man schnell fest, dass einem diese wunderbare Theorie der Energielandschaft nichts bringt, weil sie einem nicht ansatzweise erklären kann, welche Aminosäure oder Struktur des Proteins wann welche Form an welcher Stelle im Raum einnimmt oder einnehmen wird. Gelehrte heiße Luft, die verbergen soll, dass man überhaupt keine Ahnung hat, wie und warum das Protein zu diesem Zeitpunkt gerade so faltet, wie es faltet und nicht anders. Man kann aber trefflich über diese Theorie philosophieren und in einem ist man sich letztendlich einig: Ja, die Gesamtenergie wird im Endprodukt wohl am niedrigsten sein. Alla gut! Würden die Lallers (alte SWR2 Radio Comedy) an dieser Stelle wohl sagen.

Das Review von Waudby hat dann aber wunderschön ausformuliert, was im Schülerduden nur im Bild angedeutet ist:

Wenn die Translation (Übersetzung der mRNA in Protein) schnell ist (k_Translation > k_Faltung), dann wird die Faltung von einem ungeordneten Zustand in der Polypeptidkette in voller Länge eingeleitet, und das Risiko der Bildung von kinetisch gefangenen und potenziell fehlgefalteten Zwischenstufen ist erhöht (magentafarbene Faltungsweg). […] Wenn jedoch die Faltung im Verhältnis zur Translation schnell ist (k_Faltung > k_Translation), dann ist es unwahrscheinlich, dass dieser fehlgefaltete Zustand auftritt, da die meisten Polypeptide sich sequenziell über die N-terminale Domäne falten (orangefarbener Faltungsweg). Daher ist es in dieser Situation eindeutig wünschenswert, dass die Translationsrate im Verhältnis zur Faltungsrate reduziert wird, damit der co-translationale Faltungsprozess die effiziente Synthese vollständig gefalteter Proteine möglichst effektiv unterstützen kann.

Im Klartext, wenn zu schnell zu viel abgelesen wird, steigt die Wahrscheinlichkeit er Proteinfehlfaltung und das weiß man auch. (Es kann natürlich in Einzelfällen wünschenswert sein, dass empfindliche Bereiche eines Proteins schneller produziert werden und schneller falten, damit sie keinen Schaden nehmen. Daher wird die Geschwindigkeit der Proteinproduktion über die jeweilige Verfügbarkeit der tRNAs reguliert.)

Zur Erinnerung: Was hat Ugur gemacht? Er will von den Körperzellen schnell und viel Protein herstellen lassen und arbeitet ERNEUT nach dem Motto viel hilft viel. «Da wir nicht wissen, was nötig ist, sollten wir beim Maximum anfangen», hatte Ugur erklärt.“ (Projekt Lightspeed, S. 220).

Da gibt es noch eine „Kleinigkeit“ die Ugur nicht bedacht hat: Die Evolution! Jahrtausende, wenn nicht Jahrmillionen Jahre, in denen sich Sequenzen über Versuch und Irrtum aus gutem Grund zu einer ganz bestimmten Codonnutzung (codon usage) optimiert haben.

Waudby schreibt es in seinem Review in ganz einfach zu verstehenden Worten, die man auch Fachfremder beim Querlesen verstehen kann, wenn man denn will:

Es gibt inzwischen eindeutige Belege dafür, dass kotranslationale Faltung und Translationskinetik einer evolutionären Selektion unterliegen[12] [13] , und dass eine Störung dieser Abstimmung zu Fehlfaltung und beeinträchtigter Proteinsynthese führen kann[14] [15] [16] [17].

Ach nee, was Du nicht sagst Sherlock.

Schon, wenn man in den im obigen Satz zitierten Papern nur den Abstract liest, hätte einem klar sein müssen, dass Codon Optimierung eine echt so richtig schlechte Idee ist, so richtig, richtig saudumm:

Die Wahl der Codons kann die lokale Translationskinetik während der Proteinsynthese beeinflussen.[18]

Wir beschreiben einen robusten statistischen Ansatz zur Identifizierung von Loci innerhalb von Genen, die sowohl signifikant mit langsam übersetzten Codons angereichert als auch evolutionär konserviert sind.[19] – Hat man das vorher überprüft bei der Codon Optimierung?

Teilweise steht es sogar direkt in der Überschrift der Publikationen wie:

Nicht optimaler Codongebrauch beeinträchtigt Expression, Struktur und Funktion des Uhrenproteins FRQ[20], da muss man nicht einmal das ganze Paper oder auch nur den Abstract lesen.

So richtig, richtig lustig, wird es, wenn eine stille Mutation, welche die Aminsäuresequenz des Proteins NICHT verändert hat zu einer komplett anderen Substratspezifiät führt[21]. Oups…

„Wir stellen die Hypothese auf, dass das Vorhandensein eines seltenen Codons, das durch den synonymen Polymorphismus gekennzeichnet ist, den Zeitpunkt der kotranslationalen Faltung und des Einbaus von P-gp in die Membran beeinflusst und dadurch die Struktur der Substrat- und Inhibitor-Interaktionsstellen verändert.“

Zu dem Themenkomplex gibt es direkt auch ein ganzes Paper:

„In allen Genomen werden die meisten Aminosäuren durch mehr als ein Codon kodiert. Synonyme Codons können die Proteinproduktion und -faltung beeinflussen, aber der Mechanismus, der die Codonverwendung mit der Proteinhomöostase verbindet, ist nicht bekannt.“[22]

Ich denke, dieser Satz aus dem Waudby Review sagt alles, dem ist nichts hinzuzufügen:

Die Geschwindigkeit der Translation im Verhältnis zur Faltungsgeschwindigkeit ist von zentraler Bedeutung für den Ausgang und das Ergebnis der co-translationalen Faltung. (The rate of translation relative to that of folding is of central importance in defining the outcome of co-translational folding).

Und an dieser Geschwindigkeit hat Ugur komplett sinnbefreit herumgeschraubt und geglaubt, dass schon nichts passieren würde. 6! Setzen!

Sind entsprechende Folgen der in den Publikationen angedeuteten Codonoptimierung für das Spike-Protein mittlerweile nachgewiesen? Ja, sogar von Ugur selbst, man kann es kaum glauben:

„Die Nukleotidsequenz für den knubbeligen Stachel war leicht (Hervorhebung von mir) verändert worden, um die Produktion durch die Körperzellen zu optimieren. Der Impfstoff mit der Bezeichnung BNT162b2.9 war gerade erst an Mäusen getestet worden, und Blutproben der Nager waren an Muik geliefert worden. Die Ergebnisse waren eindeutig: Er hatte eine weitaus bessere Antikörperreaktion ausgelöst als das sehr ähnliche modRNA-Konstrukt BNT162b2.8, das bereits als Kandidat für die klinische Studie ausgewählt worden war.“ (Project Lightspeed, S. 233)

Ugur Sahin schreibt in seinem Buch selbst, dass das BNT162b2.9 immunogener ist als das Konstrukt BNT162b2.8, welches in der Phase 1 und 2 getestet wurde und das, obwohl es sich „nur“ um eine Codonoptimierung handelt[23], die, wie wir bereits beschrieben haben, zu einem komplett anderen Protein mit vollkommen anderen Eigenschaften führen kann, obwohl die Aminosäuresequenz identisch ist, rein durch einen anderen Faltungsweg aufgrund einer einzigen stillen Mutation bzw. sehr, sehr vieler stiller Mutationen im Falle der Codonoptimierung.

Warum das so ist, weiß aber keiner. Die Warnzeichen hat wohl keiner verstanden, schon gar nicht Ugur. Wie auch, dazu hätte er was von Proteinfaltung oder protein engineering verstehen müssen, was niemand auf diesem Planeten so wirklich tut. Im besten Fall hat man verstanden, dass man praktisch nichts weiß und versteht, dass Proteinfaltungspaper, neben ersten harten Fakten, zum Großteil aus sehr viel heißer Luft bestehen, man das Thema daher lieber in der praktischen Anwendung extrem vorsichtig angehen sollte.

Es gibt ein interessantes australisches Pfizer Dokument[24]. In diesem Dokument findet man noch einige Perlen. So findet man auf Seite 19 des foi-2389-06.pdf den Unterschied zwischen BNT162B2.8 und BNT162B2.9.

Diese beiden Varianten haben die gleiche Aminosäuresequenz, sollten also theoretisch das identische Protein ergeben. ABER sie haben eine unterschiedliche Codon Optimierung. BioNTech hat die Codons so optimiert, dass die Antigenproduktion optimiert wurde. Ein keiner Dreh an den Sequenzen und schon wurde im selben System mehr Antigen gebildet

Nur… warum ist BNT62B2.9 immunogener als BNT162B2.8? Wie kann das sein, wenn doch angeblich das gleiche Protein dabei herauskommt. Mehr Antigen bedeutet nicht zwangsläufig mehr Antikörper, zumindest hat das keiner bei BioNTech oder Pfizer jemals belegt. Warum also reagiert der Körper heftiger auf BNT162B2.9 als auf BNT162B2.8?

Der australische Senator Rennick[25]. fragt also zu Recht im australischen Parlament: „Warum haben Sie diesen Absatz im ursprünglichen FOIA Dokument geschwärzt, wenn man berücksichtig, dass dieser beweist, dass der Impfstoff mit gain-of-funktion optimiert wurde, welche die Toxizität des Impfstoffs durch die Erhöhung der Menge des Spike-Proteins erhöhte? […] Dieser Impfstoff erhöht die Antigenexpression, richtig, des Spike-Proteins. Er erhöht die Menge des Proteins, das der Impfstoff im Vergleich zum Virus bildet. Ein herkömmlicher Impfstoff ist im Allgemeinen abgeschwächt und nicht mit einer höheren Expressionsfunktion ausgestattet. Akzeptieren Sie also, dass der Impfstoff eine Funktionserweiterung darstellt?“

Worin liegt letztendlich der Unterschied zwischen dem Protein, das produziert würde mit der Originalen Codon Sequenz, und den beiden verschiedenen Optimierungen BNT162B2.8 und BNT162B2.9? Kann es sich vielleicht letztendlich aufgrund von unterschiedlichen Faltungswegen sogar um 3 unterschiedliche Proteine mit teils sogar unterschiedlicher Funktion oder Spezifitäten handeln? Theoretisch, anhand der bekannten, etablierten Literatur, wäre das durchaus möglich. Es kommt jedenfalls in Zellkultur nicht nur ein sauberes, eindeutiges Protein heraus, sondern verschiedene Varianten[26]. Ohne entsprechende Datenlage kann man darüber am Lagerfeuer nun über Jahre hinweg genüsslich philosophieren, ohne je zu einem Ergebnis zu kommen. Theoretisch kann man mit dieser Fragestellung das alte, ritualisierte Kennenlernritual auf Konferenzen ersetzen. Aus „was wird die Menschheit ausrotten, eher ein Virus oder ein Bakterium“ könnte man seine ritualisierten Diskussionen nun zu „sind das natürliche Spike BNT162B2.8 und 9 nun das gleiche Protein, oder 2 oder 3 komplett unterschiedliche Proteine“. Man kann so abchecken, wie das Gegenüber tickt und argumentiert. Die Viren versus Bakterien Frage ist irgendwie verbrannt und problematisch, wenn man auf jemanden von Next Level treffen sollte. Dann kann es ungemütlich werden und die Party ist geplatzt.

Da keiner sich bisher die Mühe gemacht hat, diese Protein Proteinbiochemisch auch nur ansatzweise und grundlegend zu charakterisieren – oder wenn doch, dann sind die Daten im schwarzen Archiv von Ugurs Hexenküche seeehr tief vergraben, genauso tief wie in den Geheimarchiven des Vatikan, ist bisher schwer bis gar nicht zu sagen, wie sich diese potentiell unterschiedlichen Proteine verhalten könnten, angefangen bei Thermostabilität über Bindungsaffinitäten zu Bindung an andere Rezeptoren.

Mittlerweile wurde zumindest für die S1 Untereinheit des Spikes (die RBD- Rezeptor binding Domain) bewiesen, dass sie fehlfaltet[27] [28] und nicht nur das, es werden teilweise komplett andere Peptide (kleine Proteinfragmente) hergestellt die so gar nichts mit dem originalen Spike-Protein gemein haben.

Nachdem wir die Theorie der Proteinfaltung im Zusammenhang mit Codonoptimierung nun soweit erklärt haben, schauen wir uns doch mal im Detail an (soweit bekannt), was BioNTech/Pfizer da dilettantisch zusammengebraut haben. Wäre das ein Masterprojekt gewesen, wäre der Student bei mir aufgrund der missachteten, bekannten biologischen Grundlagen krachend durchgefallen.

Schauen wird doch mal, wie extrem am GC Gehalt und somit an den Codons geschraubt wurde. Zur Erinnerung, ein Virus oder Pathogen ist normalerweise evolutionär an seinen Wirtsorganismus und somit an dessen tRNAs und Ribosome angepasst und hat daher aus gutem Grund eine bestimmte Codonnutzung für seine Proteine.

Kevin McKernan[29] hat sich dieses Problem mal im Detail angeschaut. Wie häufig wurden welche Basen (also A, T, C, G) verwendet.

17% höherer GC-Gehalt bei BioNTech/Pfizer und 25% mehr bei Moderna als in der Original-Spike Sequenz aus Wuhan. Das nenne ich mal sportlich, wenn man sich zurückerinnert, dass eine einzige stille Mutation bereits die Substratspezifität eines Enzyms verändern kann. Besonders mutig, wenn man so etwas dann zur Anwendung im Menschen bringt. Was kann da schon schiefgehen außer so ziemlich alles, was man sich auch nur in seinen schlimmsten Albträumen ausmalen kann.

Auch lustig, dass sich dadurch nicht nur das abgelesene Protein sondern auch schon die Sekundärstruktur der mRNA/modRNA ändert. mRNA kann regulatorische Funktion haben bei der Translation, weil diese Strukturen nicht so einfach durch das Ribosom gehen, als wenn es eine gerade ungefaltete mRNA wäre.

Auch da hat Kevin McKernan genauer drauf geschaut, wie sich denn die Sekundärstruktur der mRNA (eigentlich modRNA, aber wir lassen hier erneut diese N1-Methylpseudouridinproblematik außen vor) verändert hat. Etwas, was Ugur wohl auch nicht auf dem Schirm hatte, denn wer hätte auch ahnen können, dass die 3D Struktur der mRNA möglicherweise Einfluss auf die Translationsgeschwindigkeit nehmen könnte? Dazu hätte man ja mal ein Proteinfaltungspaper wie das von Waudby lesen müssen. Der hat dazu ein komplettes Kapitel in seinem Review:

„Als Folge der Degeneration des genetischen Codes können mRNA-Sequenzen Informationen enthalten, die über die primäre Polypeptidsequenz hinausgehen, und es hat sich gezeigt, dass diese Fähigkeit die Translationsgeschwindigkeit durch mehrere sich nicht gegenseitig ausschließende Mechanismen beeinflusst.[…] (W)enn die Translationskinetik stark gestört ist, kann dies zu einer Störung der Proteostase und zu Krankheiten führen.“

Und hier wird es nun noch mal spannend:

„Zweitens können stabile mRNA-Sekundärstrukturelemente in einer begrenzten Anzahl von Fällen auch die Translationsrate verlangsamen. In vitro ist der Einfluss der mRNA-Struktur auf die Translation eindeutig und wurde mit Hilfe von Einzelmolekülmessungen im Detail verfolgt.“

Dass RNA solche Strukturen macht, lernt man normalerweise in der Vorlesung „Einführung in die Genetik“ im ersten Semester und das schon vor 20 Jahren.

So auf den ersten Blick kommen mir die codonoptimierten modRNAs schon ein wenig einfach gestrickt vor in ihrer Sekundärstruktur im Vergleich zum Original.

=== Fazit ===
Wenn ich Ugur vor Gericht gegenüberstünde, würde ich ihm bezüglich der Codonoptimierung gerne ein paar Fragen stellen:

1.      Es ist aus der Literatur hinlänglich bekannt, dass selbst eine stille Mutation bereits die Faltung eines Protein so verändern kann, dass es eine andere Substratspezifität aufweist. Haben Sie den Einfluss der optimierten Codons auf die Proteintranslation und deren Einfluss auf die Proteinfaltung hin überprüft? Wenn ja, mit welchem Ergebnis? Wenn nein, warum nicht und sind sie sich des damit einhergehenden Risikos bewusst gewesen?

2.      Haben Sie untersucht, warum BNT162B2.9 immunogener ist als BNT162B2.8? Wenn ja, was war das Ergebnis. Wenn nein, warum nicht?

3.      Haben Sie den Unterschied der veränderten mRNA Struktur auf das Translations- und somit Faltungsverhalten des resultierenden Proteins untersucht? Wenn ja, was war das Ergebnis? Wenn nein, warum nicht?

4.      Haben sie die potentiell unterschiedliche tRNA Ausstattung verschiedener menschlicher Gewebe bei der Translation des Spike-Proteins berücksichtigt?

5.      Hatten Sie überhaupt jemanden im Team, der von so etwas auch nur ansatzweise eine Ahnung von protein engineering hatte oder hat?

[1] https://pingthread.com/hashtag/COptiGate

[2] Eiweißsynthese in Biologie | Schülerlexikon | Lernhelfer. (n.d.). https://www.lernhelfer.de/schuelerlexikon/biologie/artikel/eiweisssynthese

[3] Goodenbour JM, Pan T. Diversity of tRNA genes in eukaryotes. Nucleic Acids Res. 2006;34(21):6137-46. doi: 10.1093/nar/gkl725. Epub 2006 Nov 6. PMID: 17088292; PMCID: PMC1693877. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1693877/

[4] Hughes LA, Rudler DL, Siira SJ, McCubbin T, Raven SA, Browne JM, Ermer JA, Rientjes J, Rodger J, Marcellin E, Rackham O, Filipovska A. Copy number variation in tRNA isodecoder genes impairs mammalian development and balanced translation. Nat Commun. 2023 Apr 18;14(1):2210. doi: 10.1038/s41467-023-37843-9. PMID: 37072429; PMCID: PMC10113395. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37072429/

[5] Hagenbüchle O, Larson D, Hall GI, Sprague KU. The primary transcription product of a silkworm alanine tRNA gene: identification of in vitro sites of initiation, termination and processing. Cell. 1979 Dec;18(4):1217-29. doi: 10.1016/0092-8674(79)90234-4. PMID: 519766. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/519766/

[6] Joomi. (2023, May 17). New study shows how little we know about how mRNA vaccines “work.” Substack. https://joomi.substack.com/p/new-study-shows-how-little-we-know

[7] Cari L, Naghavi Alhosseini M, Mencacci A, Migliorati G, Nocentini G. Differences in the Expression Levels of SARS-CoV-2 Spike Protein in Cells Treated with mRNA-Based COVID-19 Vaccines: A Study on Vaccines from the Real World. Vaccines (Basel). 2023 Apr 21;11(4):879. doi: 10.3390/vaccines11040879. PMID: 37112792; PMCID: PMC10144021. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37112792/

[8] Zhang G, Hubalewska M, Ignatova Z. Transient ribosomal attenuation coordinates protein synthesis and co-translational folding. Nat Struct Mol Biol. 2009 Mar;16(3):274-80. doi: 10.1038/nsmb.1554. Epub 2009 Feb 8. PMID: 19198590. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19198590/

[9] Sørensen MA, Kurland CG, Pedersen S. Codon usage determines translation rate in Escherichia coli. J Mol Biol. 1989 May 20;207(2):365-77. doi: 10.1016/0022-2836(89)90260-x. PMID: 2474074. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/2474074/

[10] Fluitt A, Pienaar E, Viljoen H. Ribosome kinetics and aa-tRNA competition determine rate and fidelity of peptide synthesis. Comput Biol Chem. 2007 Oct;31(5-6):335-46. doi: 10.1016/j.compbiolchem.2007.07.003. Epub 2007 Aug 15. PMID: 17897886; PMCID: PMC2727733. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17897886/

[11] Waudby CA, Dobson CM, Christodoulou J. Nature and Regulation of Protein Folding on the Ribosome. Trends Biochem Sci. 2019 Nov;44(11):914-926. doi: 10.1016/j.tibs.2019.06.008. Epub 2019 Jul 10. PMID: 31301980; PMCID: PMC7471843. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31301980/

[12] Pechmann S, Frydman J. Evolutionary conservation of codon optimality reveals hidden signatures of cotranslational folding. Nat Struct Mol Biol. 2013 Feb;20(2):237-43. doi: 10.1038/nsmb.2466. Epub 2012 Dec 23. PMID: 23262490; PMCID: PMC3565066. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23262490/

[13] Jacobs WM, Shakhnovich EI. Evidence of evolutionary selection for cotranslational folding. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Oct 24;114(43):11434-11439. doi: 10.1073/pnas.1705772114. Epub 2017 Oct 10. PMID: 29073068; PMCID: PMC5664504. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29073068/

[14] Zhang G, Hubalewska M, Ignatova Z. Transient ribosomal attenuation coordinates protein synthesis and co-translational folding. Nat Struct Mol Biol. 2009 Mar;16(3):274-80. doi: 10.1038/nsmb.1554. Epub 2009 Feb 8. PMID: 19198590. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19198590/

[15] Zhou M, Guo J, Cha J, Chae M, Chen S, Barral JM, Sachs MS, Liu Y. Non-optimal codon usage affects expression, structure and function of clock protein FRQ. Nature. 2013 Mar 7;495(7439):111-5. doi: 10.1038/nature11833. Epub 2013 Feb 17. PMID: 23417067; PMCID: PMC3629845. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23417067/

[16] Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, Sauna ZE, Calcagno AM, Ambudkar SV, Gottesman MM. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 2007 Jan 26;315(5811):525-8. doi: 10.1126/science.1135308. Epub 2006 Dec 21. Erratum in: Science. 2007 Nov 30;318(5855):1382-3. Erratum in: Science. 2011 oCT 7;334(6052):39. PMID: 17185560. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17185560/

[17] Kim SJ, Yoon JS, Shishido H, Yang Z, Rooney LA, Barral JM, Skach WR. Protein folding. Translational tuning optimizes nascent protein folding in cells. Science. 2015 Apr 24;348(6233):444-8. doi: 10.1126/science.aaa3974. PMID: 25908822 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25908822/

[18] Pechmann S, Frydman J. Evolutionary conservation of codon optimality reveals hidden signatures of cotranslational folding. Nat Struct Mol Biol. 2013 Feb;20(2):237-43. doi: 10.1038/nsmb.2466. Epub 2012 Dec 23. PMID: 23262490; PMCID: PMC3565066. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23262490/

[19] Jacobs WM, Shakhnovich EI. Evidence of evolutionary selection for cotranslational folding. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Oct 24;114(43):11434-11439. doi: 10.1073/pnas.1705772114. Epub 2017 Oct 10. PMID: 29073068; PMCID: PMC5664504. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29073068/

[20] Zhou M, Guo J, Cha J, Chae M, Chen S, Barral JM, Sachs MS, Liu Y. Non-optimal codon usage affects expression, structure and function of clock protein FRQ. Nature. 2013 Mar 7;495(7439):111-5. doi: 10.1038/nature11833. Epub 2013 Feb 17. PMID: 23417067; PMCID: PMC3629845. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23417067/

[21] Kimchi-Sarfaty C, Oh JM, Kim IW, Sauna ZE, Calcagno AM, Ambudkar SV, Gottesman MM. A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science. 2007 Jan 26;315(5811):525-8. doi: 10.1126/science.1135308. Epub 2006 Dec 21. Erratum in: Science. 2007 Nov 30;318(5855):1382-3. Erratum in: Science. 2011 oCT 7;334(6052):39. PMID: 17185560. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17185560/

[22] Buhr F, Jha S, Thommen M, Mittelstaet J, Kutz F, Schwalbe H, Rodnina MV, Komar AA. Synonymous Codons Direct Cotranslational Folding toward Different Protein Conformations. Mol Cell. 2016 Feb 4;61(3):341-351. doi: 10.1016/j.molcel.2016.01.008. PMID: 26849192; PMCID: PMC4745992. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26849192/

[23] https://phmpt.org/wp-content/uploads/2023/01/125742_S21_M1_pharmacovigilance-plan.pdf#page=1 Seite 9f

[24] https://www.tga.gov.au/sites/default/files/foi-2389-06.pdf

[25] Rennick, O. O. S. G., & Rennick, O. O. S. G. (2023, March 14). Gain-of-function research in Australia: Why the secrecy? - Senator Gerard Rennick. Senator Gerard Rennick. https://gerardrennick.com.au/gain-of-function-research-in-australia-why-the-secrecy

[26] Jiang H, Mei YF. SARS-CoV-2 Spike Impairs DNA Damage Repair and Inhibits V(D)J Recombination In Vitro. Viruses. 2021 Oct 13;13(10):2056. doi: 10.3390/v13102056. Retraction in: Viruses. 2022 May 10;14(5): PMID: 34696485; PMCID: PMC8538446. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34696485/

[27] Patterson, B. W., Francisco, E. B., Yogendra, R., Long, E., Pise, A., Beaty, C. D., Osgood, E., Bream, J. B., Kreimer, M., Heide, R. S. V., Guevara-Coto, J., Mora, R., & Mora, J. (2022). SARS-CoV-2 S1 Protein Persistence in SARS-CoV-2 Negative Post-Vaccination Individuals with Long COVID/ PASC-Like Symptoms. Research Square (Research Square). https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1844677/v1

[28] J. (2022, September 29). What proteins are we actually getting from the COVID vaccines? https://joomi.substack.com/p/what-proteins-are-we-actually-getting?utm_campaign=post&utm_medium=web&utm_source=direct

[29] McKernan, K., Kyriakopoulos, A. M., & McCullough, P. A. (2021, November 25). Differences in Vaccine and SARS-CoV-2 Replication Derived mRNA: Implications for Cell Biology and Future Disease. https://doi.org/10.31219/osf.io/bcsa6

Update:

09.05.2024 (A critical analysis of codon optimization in human therapeutics - PubMed (nih.gov))

Ich argumentiere gerne auf dem alten Stand der Technik und des von vor 10-15 Jahren, weil das den Mitarbeitern und Wissenschaftlern, die die Schlumpfungen verbrochen haben, alles bewusst gewesen sein muss, eben WEIL es 10-15 Jahre altes Wissen ist, das man somit vorraussetzen können sollte. Bevor man ein Projekt anfasst, beschäftigt man sich mit der Vorhandenen Literatur zu diesem Themenkomplex. In diesem Falle wären das z. Bsp. ein paar Übersichtsartikel (Reviews) zum Thema Proteinfaltung und was man dazu weiß oder eben nicht weiß. Zumindest das Niveau von Übersichtsartikeln sollte man voraussetzen dürfen.

Fangen wir also mit den ganz einfachen Sachen an, die man lernt, wenn man im Labor ein Protein exprimiert also in einem Organismus herstellt. Ich habe nur in E.Coli gearbeitet, einfache Prokaryotengenetik (Menschen und Pflanzen sind Eukaryoten, haben also einen Zellkern, anders als Bakterien, die haben keinen Zellkern, daher Prokaryoten). Ich brauchte mir um Poly-A-Schwänze keine Gedanken machen wie das bei Eukaryoten wie dem Menschen oder der Maus der Fall gewesen wäre. Dennoch war bereits das Protein Engineering in E.Coli tückisch ohne diese zusätzlichen Probleme, die das Problem weiter verkompliziert hätten.

Meine „Analyse“ der Probleme mit der Konstruktion des Impfspikes beruhen auf den Beobachtungen und experimentellen Erfahrungen meiner Promotion, die jeder in der UB Freiburg einsehen kann (Mein Chef hat es leider nie geschafft, meine Paper Drafts auch einzureichen) und Übersichtsartikeln, um diese wissenschaftlich zu untermauern.

Mein Promotionsprojekt war ganz einfach erklärt folgendes:

Man nehme ein Protein (Eiweiß) und schneide an seinem vorderen Ende (N-Terminus) und/oder seinem hinteren Ende (C-Terminus) so lange Aminosäuren ab, bis es kaputt ist und keine Aktivität mehr zeigt. Mein Protein hieß CAT I (Chloramphenicolacetyltransferase 1, das Enzym, das für die Resistenz gegen Chloramphenicol (ein Anitbiotikum) verantwortlich ist). Wenn man bei CAT I am N-Terminus 10 Aminosäuren abschneidet ist es kaputt. Schneidet man am C-Terminus 9 Aminosäuren ab, ist es auch kaputt. Das erkennt man daran, dass E.Coli Kulturen, die man auf Nährmedium ausbringt, welches dieses Antibiotikum enthält, nicht mehr wachsen können und durch das Antibiotikum getötet werden. Wächst etwas, sieht man das auf Agarplatten als Kolonie oder in Flüssigkultur als Trübung. Eine ganz einfache Ja/Nein Selektion.

Mit evolutionären Methoden, die ich in meinem Substack über directed protein evolution beschrieben habe[v], mutiert man das Protein und selektiert nach Mutanten, die wieder aktiv sind, was bei einer Antibiotikaresistenz denkbar einfach ist. Funktioniert das Enzym nicht, wachsen die Bakterien auf diesem Antibiotikum nicht. Wachsen sie, muss wohl mit den Enzym irgendetwas passiert sein, dass es wieder ohne sein abgeschnittenes Ende, aktiviert hat.

In meinem Fall reichten 2 Mutationen die fehlenden 10 Aminosäuren des N-Terminus auszugleichen (I84V und S87R) und 4 Mutationen die fehlenden 9 Aminosäuren des C-Terminus auszugleichen (M67V, D111H, I119T, F138S).

Diese Änderungen passieren irgendwo im Enzym, an einer ganz anderen Stelle als an jener, wo man das Ende abgeschnitten hat. Die Änderungen sind überraschend, unvorhersehbar und ehrlicher Weise schwer erklärbar. Ein Wissenschaftler drückt das dann so aus: Es handelt sich um Effekte über lange Distanz. Möglicherweise stabilisiert die zusätzliche Wasserstoffbrücke die Struktur. Durch die gefundene Mutation können wir in Zukunft mehr über Proteinfaltung und Proteinstruktur lernen. Im Klartext: Ich habe keine Ahnung, wäre nie auf die Idee gekommen diese Mutationen zu machen und ich weiß nicht, warum sie funktionieren.

Wie kommt es aber, dass man sich sollte Hypothesen aus den Fingern saugen kann und wie belegt man diese?

Dafür verwendet man „Fotos“ des Proteins, die man gemacht hat, indem man einen Kristall des Proteins gezüchtet hat (oder jemand anders hat das gemacht) und dann mittels Röntgenstrukturanalyse, die Position jedes einzelnen Atoms des Proteins „fotografiert“ hat. Das Ergebnis dieser Röntgenfotos findet man in einer zentralen Proteindatenbank namens PDB[vi] (Protein Data Base).

Wenn es keine Möglichkeit gibt einen Kristall zu züchten oder das Bild zu unscharf ist, gibt es noch andere Möglichkeiten zumindest eine Näherung zu bekommen, wie ein Protein aussieht. Man kann ein unscharfes Elektronenmikroskopisches Foto machen und dann ein Modell generieren, das in dieses unscharfe Foto hineinpasst. Das sind dann diese 3D-Strukturen in der Proteindatenbank, die mittels Cryo- Elektronenmikroskopie gemacht wurden. So zumindest verstehe ich diese Methode. Vielleicht tue ich ihr damit aber auch Unrecht. Wir werden sehen.

Cryo-EM macht man besonders gerne für Membranproteine, weil sie bekanntermaßen keine gescheiten Kristalle produzieren, wohl auch wegen ihrer Flexibilität[vii]. Flexibilität und Stabilität, da war doch was. Darauf werde ich in den folgenden Kapiteln noch näher eingehen. ABER, wenn ein Protein keine gescheite Struktur erzeugen lässt, weil es flexibel ist und sich somit in einem labilen Gleichgewicht verschiedener Konfirmationen befindet, sollten die Alarmglocken angehen, dass man von so einem Protein geflissentlich die Finger lässt. Wäre nur so eine Idee.

Ich selbst habe nie mit Cryo-EM oder Cryo-EM Strukturen hantiert, kann also nicht exakt beurteilen, wie brauchbar diese sind. Aber dazu kommen wir noch in einem der späteren Kapitel.

Im Impfspike hat man einfach so zwei Aminosäuren im „Stamm“ des brokkoliartigen Spikes ausgetauscht und behauptet, dass dieses dann nicht mehr an ACE2 binden würde. Biacore-Messungen, die das belegen würden, wurden nicht durchgeführt. Aus eigener Erfahrung kann ich sagen, der Austausch von 2 Aminosäuren kann einen großen Effekt auf die komplette Struktur eines Proteins haben, den man nicht erklären kann. Schon diese zwei Proline, das sogenannte Proline-Schloss, können die Struktur des Proteins theoretisch „verziehen“ und zwar über lange Distanz. Welchen Effekt das hat, kann man leider nicht sagen, weil entsprechende Messungen (CD Schmelzkurven, Biacore Bindungsmessungen, Kristallstrukturen von aus Menschen isolierten Impfspikes) nicht vorliegen. Was diese Messungen messen und warum ich die gemacht hätte, darauf werde ich in einem der folgenden Kapitel ausführlicher eingehen.

Eine weitere Lektion, die man als Doktorand im Protein Engineering leidvoll lernt ist, dass die codon usage, also welcher der vielen Triplet Codes für eine Aminosäure verwendet wird, einen großen Einfluss auf das Verhalten der Zellen haben kann. Im schlimmsten Fall hat man einen sehr seltenen Triplet Code in seiner Sequenz, es kommt zu einem Mangel der entsprechenden tRNA im produzierenden Organismus und die Zellen sterben oder man verwendet von einer Aminosäure zu viel, so dass dem Organismus diese Aminosäure vor sein Überleben fehlt und er daher nicht gescheit wächst oder stirbt. Dumm gelaufen. Nun ist es so, dass das Impfspike bei seiner unkontrollierten Produktion ganz offensichtlich ordentlich Prolin verbraucht was bei den behandelten Menschen im Blut wohl teilweise zu Prolinmangel führt. Hätte man vielleicht vorher bedenken sollen und schauen sollen, wie die Aminosäurenverteilung und deren Verbrauch im produzierenden Organismus Mensch ist. Ich kann jetzt nicht genau sagen, wie das bei Prolin und Menschen ist, aber Prolin ist eine sogenannte essentiellen Aminosäure, die ein Mensch von außen zuführen muss. Davon hat man nicht allzu viel vorrätig. Ob es nun sinnvoll wäre Prolin zu begrenzen, damit nicht zu viel Spike produziert wird oder Prolin zuzuführen, um Prolinmangel auszugeleich, wäre eine Interessante Fragestellung, die ich nicht beantworten kann.

Meine am C-Terminus um 9 Aminosäuren verkürzte CAT I Variante galt als nicht reinigbar, weil sie im produzierenden Organismus zu sogenannten inclusion bodies (einschlusskörperchen) führte, d.h. das produzierende E.Coli hat das fehlgefaltete Protein irgendwo in einer Ecke als Feststoff abgelegt. Das lag aber wohl daran, dass man immer versucht hat „traditionell“ zu reinigen. „Traditionell“ werden Proteine in E.Coli bei 30°C produziert, weil man glaubt, dass dann mehr Protein hergestellt wird und die Zelle langsamer wächst. Beweise dafür hat man mir aber nie vorgelegt. In der Chemie hingegen gibt es die sogenannte RGT Regel, die man in der Chemie der Mittelstufe lernt. Die RGT Regel (Reaktionsgeschwindigkeit-Temperatur-Regel, auch van-’t-Hoff’sche Regel) besagt, dass chemische Reaktionen bei einer um 10 °C erhöhten Temperatur ungefähr doppelt bis viermal so schnell ablaufen. Als fauler Doktorand habe ich daher meine Mutante bei 37°C statt 30°C exprimiert, weil die Zellen natürlich schneller wuchsen, das Protein von Natur aus eigentlich thermostabil war und bei 50°C-70°C am glücklichsten und schnellsten, und weil ich den 30°C Schüttler, der umständlich zu bedienen war, nicht buchen musste. Und siehe da! Das in der Literatur als nicht reinigbar bezeichnete Protein ließ sich plötzlich reinigen, weil es bei höheren Temperaturen höchstwahrscheinlich schneller abgelesen wurde und plötzlich doch falten konnte. Ich hatte durch die höhere Expressionstemperatur an der Produktionsgeschwindigkeit der Ribosomen geschraubt (RGT Regel halt), und plötzlich faltete es. Was bedeutet das für das Impfspike? Man hat bei der Konstruktion der modRNA am CG Gehalt der Tripletcodes geschraubt, um die Ausbeute an Spike zu erhöhen, man hat also an der Lesegeschwindigkeit und der Produktionsmenge des Proteins herummanipuliert. Die Lesegeschwindigkeit der Ribosomen hat (zumindest in Prokaryoten) einen großen Einfluss darauf wie und ob ein Protein faltet oder irgendwo als fehlgefalteter Proteinmüll in einer Ecke der Zelle abgelegt wird. Man hat also durch das verändern der Tripletcodes zu Varianten mit hohem GC Gehalt möglicherweise alternative und generell andere Faltungswege des Proteins aktiviert. Welche Form dieses „Impfspike“ nun also annimmt, weiß man nicht (ganz abgesehen, dass man da noch 2 Proline hat, die auch den Faltungsweg beeinflussen können). Um das sicher zu wissen müsste man das nun produzierte Impfspike es aus einem Menschen reinigen (mittels Apharese?) und anschließend kristallisieren, was man natürlich nicht gemacht hat.

Hinzu kommt ein weiterer Anfängerfehler, für den mein Doktorvater mich geköpft hätte. Ein DNA oder RNA Konstrukt, welches zur Proteinproduktion verwendet wird, wird aus Sicherheitsgründen im Hauptleseraster mit 2 starken Stopps hintereinander, anschließend jeweils einem Stopp in den beiden Nebenleserastern und optional noch ein drittes Mal im Hauptleseraster gestoppt, damit keine zu langen Proteine gebildet werden oder bei einer Rasterschubmutation auch gestoppt wird. Das ist bei den modRNAs nicht der Fall, die nur im Hauptleseraster gestoppt wurden und das mit 2 schwachen Stopps, soweit ich weiß. Natürlich vorkommende Proteine haben häufig ohnehin stille Stopps in den Nebenleserastern, so dass man sich darum normalerweise keine Sorgen machen muss und sich das Blocken der Nebenleseraster auch sparen kann. Sollte das aber nicht der Fall sein, wäre es wünschenswert, diese Nebenleseraster mit einem starken Stopp zu blocken.

Fassen wir also mal die unbedachten Anfängerfehler dieses Impfspikekonstrukts, rein basierend auf leidvollen Erinnerungen meiner Promotion, zusammen:

1.      Es wurde nicht bedacht, dass der Austausch von 2 Aminosäuren die komplette Proteinstruktur beeinfluss und „verziehen“ kann und zu unerwünschten Langstreckeneffekten in der Proteinstruktur führen kann.

2.      Es wurde nicht bedacht, dass der Austausch von 2 Aminosäuren die Faltung und den Faltungsweg des Proteins beeinflussen kann.

3.      Es wurde nicht bedacht, dass die Beeinflussung der Lesegeschwindigkeit bei der Proteinproduktion die Faltung und den Faltungsweg verändern kann.

4.      Das zu produzierende Protein wurde nur mit leaky Stopps beendet, die Nebenleseraster nicht geblockt, was bei einer Humananwendung extrem wünschenswert gewesen wäre.

5.      Das Endprodukt wurde nicht biophysikalisch mittels Biacore- Messung (Bindung an ACE2), CD- Schmelzkurve (Charakterisierung der Proteinstruktur in Abhängigkeit der Temperatur), Kristallstruktur (wie sieht das Endprodukt wirklich aus) charakterisiert.

Und das sind nur Ableitungen aus meinen persönlichen leidvollen Laborerfahrungen, dafür muss ich nicht einmal in die Literatur schauen, um zu wissen, dass bei der Konstruktion des Spike-Proteins so richtig scheiße gebaut wurde.

DAS kommt in den folgenden Kapiteln. Da schaue ich tiefer in die Literatur, die meine leidvollen Erfahrungen erklären wird.

Hätte Ugur doch einfach jemanden gefragt, der so was Ähnliches schon mal mit einem thermostabilen, trimeren Protein gemacht hat.

Einmal mit Profis arbeiten, sage ich da nur.

[i] FreiDok plus - Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling And Mutational studies on chloramphenicol actetyltransferase I (CATI). (n.d.). https://freidok.uni-freiburg.de/data/11610

[ii] Stebel, S. C., Arndt, K. M., & Müller, K. M. (2006). Versatile DNA Fragmentation and Directed Evolution With Nucleotide Exchange and Excision Technology. In Humana Press eBooks (pp. 167–190). https://doi.org/10.1385/1-59745-187-8:167

[iii] (Stebel, 2007, p. 631) Directed Protein Evolution. In K. Müller & K. Arndt (Eds.), Protein Engineering Protocols (Vol. 349, pp. 631-656). Springer Science & Business Media

[iv] Eigentlich hätte ich hier Erstautor sein müssen. Den hat sich aber mein Doktorvater genommen und seiner Frau den Letztautor gegeben, den sie noch dringen für einen Antrag oder eine Bewerbung brauchte. Daher wurde ich auf die TA Position verbannt. Damit war meine Karriere in der Wissenschaft ohnehin tot. Meine restlichen Paperdrafts aus der Promotion hat er auch nie veröffentlicht. Wir haben und nicht direkt im Guten getrennt, könnte man sagen. Müller KM, Stebel SC, Knall S, Zipf G, Bernauer HS, Arndt KM. Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling: a robust method for DNA fragmentation and directed evolution. Nucleic Acids Res. 2005 Aug 1;33(13):e117. doi: 10.1093/nar/gni116. PMID: 16061932; PMCID: PMC1182171.

[v] Vitriol, D. V. (2023, January 27). Directed (Protein) Evolution. By DrBines Verbales Vitriol. https://drbine.substack.com/p/directed-protein-evolution

[vi] Bank, R. P. D. (n.d.). RCSB PDB: Homepage. https://www.rcsb.org/

[vii] García-Nafría J, Tate CG. Cryo-Electron Microscopy: Moving Beyond X-Ray Crystal Structures for Drug Receptors and Drug Development. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2020 Jan 6;60:51-71. doi: 10.1146/annurev-pharmtox-010919-023545. Epub 2019 Jul 26. PMID: 31348870. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31348870/

Caveat: Jeder Wissenschaftler sieht das Spike NATÜRLICH durch den Rahmen/Frame seiner eigenen wissenschaftlichen Laborerfahrungen. Für mich sieht so was daher natürlicherweise nach directed Evolution aus, weil ich das gemacht habe, und andere Methoden, wie man das hätte machen können, möglicherweise gar nicht kenne. Das heißt NICHT, dass das Spike wirklich so gebaut wurde, es wäre aber eine theoretische, sehr einfache Möglichkeit, die jeder Praktikant soweit unbemerkt durchziehen könnte.

Da aufgrund des versteckten Interviews von Project Veritas mit Jordon Trishton Walker[i], der angeblich ein Forscher bei Pfizer in NY ist (ich sage angeblich, weil es unter den Wissenschaftlern gerade eine heiße Diskussion gibt, ob er wirklich so eine Position innehaben kann, sein Lebenslauf würde so eine Position nicht hergeben…) das Thema directed Evolution gerade hochkocht, es aber gerade mal eine Handvoll Wissenschaftler geben dürfte, die auf dem Gebiet gearbeitet haben und die aus meinem damaligen Labor arbeiten nun für BAYER, GSK oder BioNTech (Jaaaaaaa, meine experimentelle andere Hälfte, die ein praktisch identisches Projekt, aber mit anderen Eiweiß (Er: Monomer TEM-1, Ich: Trimer CAT 1) arbeitet nun bei BioNTech, nur so, ob die dazu in er Lage wären: JA), bleibt der Artikel halt an mir hängen, weil es in der Wissenschaftlergemeinde der Widerstandes international außer mir keinen zu geben scheint, der auf dem Gebiet unterwegs war. Irgendwas habe ich wohl falsch gemacht. Meine Mitdoktoranden verdienen mit ihrem Wissen nun ordentlich Schotter und ich schreibe kostenlose Substacks.

Wissenschaftler sind nicht mehr Ziel meiner Artikel (das habe ich ehrlich gesagt aufgegeben), sondern die wachen, interessierten Normalos ohne Studium aber mit ordentlicher Ausbildung. Daher, liebe Wissenschaftler, wenn ihr euch doch auf meinen Substack verirrt, ich verlinke die hardcore Artikel, der Text bleibt aber hoffentlich auf einem allgemeinverständlichen Niveau (obwohl ich laut meiner Betreuerin im Referendariat erhebliche Defizite in der didaktischen Reduktion habe. Mir wurde zumindest bescheinigt, dass ich am besten in die Erwachsenenbildung passe und da bin ich nun wohl auch gelandet mit meinem Substack). Ich versuche auf ein VHS Niveau runterzubrechen, kann aber nicht garantieren, dass das auch funktioniert. Wissenschaftlich wird dabei sicherlich Einiges auf der Strecke bleiben.

Da ich keine Lust mehr habe es allen, die mich auf Telegram anschreiben, einzeln zu erklären, schreibe ich nun diesen Artikel, der nicht durch Evas (danke liebe Eva dafür) Rechtschreibkontrolle gehen wird (Kapitel 1 zu Project Light Speed ist tatsächlich schon in der Rechtschreibkontrolle). Lebt mit den Tippfehlern, der Text soll schnell raus, wird spontan aus dem Handgelenk geschüttelt und da müsst ihr halt mit Tippfehlern leben. Auf den Inhalt kommt es an, nicht auf die Schönheit. Aus einem schönen Teller wird man nicht satt, sagte immer meine Oma. Dieser Text ist unkontrollierte, ungebremste 100% DrBine.

Ironie und Sarkasmus wird es in diesem Artikel wohl auch wenig geben, das macht sprachlich einiges an Mühe und geht nur bei echt schlechten Büchern und richtig dummen Aktionen. Hier bleibt es also sachlicher und wird nicht ganz so witzig. Ich werde aber versuchen ironische Seitenhiebe spontan einzubauen, versprochen.

Was bedeutet directed Evolution eigentlich?

Ich würde directed Evolution am ehesten als durch die Umweltbedingungen zielgesteuerte Evolution bezeichnen. Also eigentlich das, war in der Natur auch passiert. Dieser evolutionäre Druck durch die Umwelt wird im Labor durch verschiedene Methoden in vitro (im Reagenzglas bzw. irgendwelchen anderen Gas-oder Plastikwaren (das ist ein leidiges Kapitel für sich)) simuliert.

Wie funktioniert directed Evolution im Labor?

Da ich immer noch genauso stinkfaul wie als Doktorand bin, werde ich mich bei meinen alten Bildern und Zeichnungen bedienen und sie nicht ins Deutsche übersetzen, sondern einfach mit Bildschirmfotos aus den alten Artikeln holen. Hab ich schon in meiner Doktorarbeit so gemacht, ich war zu faul die Fundustexte vom Laborserver ins Englische zu übersetzen, daher ist meine Doktorarbeit eine Mischung aus Deutsch und Englisch. Gab zwar 0,5 Notenabzug, war mir aber wurscht, das war meine Lebenszeit mir wert.

Das Schaubild stammt aus einem meiner alten Buchkapitel[i] und ist eine Übersicht, wie directed Evolution im Labor grundsätzlich funktioniert. Achtung: Das ist mein Kenntnisstand vor 15 Jahren. Ich habe das Thema seither nicht mehr verfolgt, weil Menschen wie ich wegen des Wissenschaftszeitvertragsgesetzes[ii] an Unis persona non grata, also nicht mehr einstellbar sind, weil es nur befristete Stellen gibt und man sich mit anstrengenden Selbstdenkern nicht langfristig (finanziell und nervlich) belasten will.

Es gibt zum einen die Möglichkeit Proteine (Eiweiße) auf einer rationalen Basis, also am Computer, zu mutieren und dann sein rationales Design auszuprobieren. Würde ich nicht empfehlen. Proteinfaltung und Modellierung am Computer waren damals noch in den Kinderschuhen, man versteht Proteinfaltung auch heute nicht ansatzweise und die Effekte von einzelnen Aminosäurenaustauschen (Aminosäuren sind die Bausteine der Proteine), kann man weder vorhersagen noch erklären (außer mit sehr viel heißer Luft, die schön klingt aber nichts sagt, wie bei Politikern. Die meisten Paper über Proteinfaltung sind heiße Luft, is aber meine persönliche Meinung).

Wer es eilig hat, wählt den Zweig der directed Evolution.

Dierectes Evolution hat mehrere Vorteile, die man nicht unterschätzen sollte:

1.      Man muss die Struktur seines Proteins nicht kennen

2.      Man muss die Funktionsweise seines Proteins weder kennen noch verstehen

3.      Man muss keine Ahnung von Proteinfaltung haben.

4.      Man muss sich keinen Kopf über den Effekt der Mutationen machen, was nicht funktioniert, fliegt im Screening einfach raus.

Kann also jeder Praktikant unauffällig nebenbei machen, sobald ein System sauber und robust aufgesetzt ist und die experimentellen Unwägbarkeiten behoben sind. Selbst in gemeinsam genutzten Laboren würde dem Wissenschaftler an der Nachbarbench nicht unbedingt auffallen, was der Kollege da eigentlich gerade treibt.

=== Schritt 1: Ich mutiere mir mein Gen ===

Als erstes muss man sein Gen diversifizieren. Wie haben ja in den letzten 3 Jahren gelernt, wie wichtig Diversität für die Gesellschaft ist. Je diverser die Genbibliothek, desto besser (also mehr als nur m/w/d + 20 weitere Geisteskrankheiten). Wir bewegen uns hier in Bereichen von mathematischen Potenzen, also seeeeeeeeeeeeeeeeeehr großen Zahlen mit vielen, vielen Nullen. Kurz gesagt, SEHR GROSS und SEHR VIEL also SEHR DIVERS (aber ohne blaue Haare und Selbstverstümmelung).

Wie bekomme ich mein Gen divers?

Mittels der sogenannten ErrorProne PCR[iii]. PCR kennen wir alle mittlerweile leider aus leidvoller dreijähriger Erfahrung, darauf wie die funktioniert gehe ich daher nicht mehr ein. Im Fall der directed Evolution nimmt man keinen Rachenabstrich, sondern 50ng (also sehr wenig) von seinem Gen, das man diversifizieren will. Im Prinzip ist eine ErrorProne PCR eine normale PCR bei der man die nervige Fehlerrate der ohnehin chronisch unzuverlässigen Taq Polymerase (die kennen wir seit 3 Jahren auch zur Genüge) noch einmal durch die Zugabe von Mangan (in Ionenform Mn2+, nicht als Metall) weiter hochtreibt. Man kann noch Magnesium (Mg2+) dazu tun, habe ich persönlich aber nicht gemacht, ich habe nur Mn2+ verwendet.

Kleine Anmerkung: Einige der Puffer der Corona PCR-Tests enthielten Mangan, z. Bsp. der von Roche…. Ein Schelm wer Böses dabei denkt.

Taq macht also bei der Produktion des Gens ordentlich Fehler, sogenannte Punktmutationen (und noch andere wie frameshift und dergleichen). Da Taq auch keine Korrekturlesefunktion hat wie ihr/e Kolleg*Innen Vent und Pfu (Ich habe keine Ahnung, ob die im Deutschen nun männlich oder weiblich sind. Die Vent, der Pfu oder umgekehrt), fällt das Taq nicht auf, sie macht einfach weiter und setzt Fehler auf Fehler.

=== Schritt 2: Deutschland sucht die perfekte Mutante/den perfekten Mutant/die perfekten Mutanten===

Dieses nun diversifizierte Gen baut man sich in einen Organismus, mit dem man eine darwinsche Selektion (also es überleben nur die Stärksten oder Passenden) durchführt. Je nach dem was und wie man selektieren will kann man in Bakterien arbeiten (hab ich gemacht) und einfach schauen, ob sie unter den Selektionsbedingungen überleben oder man sucht nach Protein:Protein Interaktion, also schaut, ob ein Eiweiß an ein anderes Eiweiß bindet. Da die meisten Leser sich wohl dafür interessieren, wie man das Spike hätte mit diesen Methoden mutieren können, gehen wir die Schritte für die Selektion der Protein:Protein Interaktion durch.

Hier würde ich als Organismus einen Bakteriophagen wählen. Also ein Bakterienvirus. Da gibt es Einige zur Auswahl[iv]. Findet man schön ausführlich bei Wikipedia erklärt, wie das funktioniert und bei wissenschaftlichen Artikeln ist Wikipedia teils noch echt OK. Diese Art des Screenings nennt sich Phage Display[v]. Auch das erklärt Wikipedia sehr schön, da brauche ich mich nicht widerholen, sonst wird es hier zu lang.

Man tauscht die „Füßchen“ eines Phagen, gegen das Protein der Wahl aus, das man auf seine Bindungseigenschaften untersuchen möchte und dann lässt man den Phagen mit seinen neuen „Füßchen“ binden. Der Auswahl des Zieles, an die der Phage binden soll, sind keine Grenzen gesetzt (außer man hat das andere Protein halt hat nicht. Nicht alles kann man direkt aus dem Katalog bestellen). Im Falle des Spike Proteins würde man schauen, ob die mutierten Spike-Füßchen des Phagen an ACE2 binden. Man kann verschiedene Varianten von ACE2 für verschiedenen Ethnien ausprobieren. Dem Screening Röhrchen ist wurscht, mit welcher Variante man es beschichtet.

Anmerkung: Das klingt jetzt alles einfacher, als es experimentell wirklich ist. Die Füßchen müssen schon zum Phagen passen, sind sie zu groß, funktioniert es nicht, man muss sich schon das richtige Phagenhaustier aussuchen für seine Experimente, das kostet Zeit. Auch die Beschichtung der Selektionsröhrchen mit dem Zielprotein ist nicht so einfach. Die Bindungschemie kann das Zielprotein verziehen oder falsch ausgerichtet an die Wand kleben, die Plastikwaren können einem weitere Probleme verursachen. Das kann durchaus dauern, bis so ein System sauber läuft und diese Probleme ausgeräumt sind. Manchmal kann man die Probleme auch einfach nicht lösen.

Gehen wir einmal davon aus, alles hat funktioniert, das Protein hat die Füßchen des Phagen so ersetzt, dass sie als neue Füßchen funktionieren. Die Phagen, die mit den neuen, mutierten Füßchen an das Ziel binden, bleiben an diesem Ziel kleben, die restlichen kippt man weg (vorzugsweise in ein verschließbares Gefäß, da anschließend autoklaviert (also hitzesterilisiert) wird. Also NICHT in den Ausguss kippen!).

Diese gebundenen Phagen, „kratzt“ mach mittels Waschlösungen (höherer pH-Wert, mehr Salz, was auch immer funktioniert, muss man halt ausprobieren), von der Wand und vermehrt sie in ihrem Wirt (meist E.Coli). Dann reinigt man die Phagen aus E.Coli (experimentelle Details erspare ich mir, das steht in der Gebrauchsanleitung des Phagenkits) schnippelt sein selektiertes Gen raus (mit den üblichen Labormethoden), sequenziert einige davon (nachdem man sie vereinzelt hat, Stichwort Phagenplaques, auch hier, dafür gibt es die Kochrezepte in Molecular Cloning[vi], das werde ich hier nicht ausführen).

Nun fängt das Spiel von vorne an.

A)     Man hat in seinen selektierten Genen nur wenige, spezielle Varianten, die sich wiederholen. Man braucht mehr Diversität als noch mal ErrorProne PCR.

B)     Man hat eine hohe Diversität hier fängt man an, diese verschiedenen Mutationen miteinander zu kombinieren, damit sie sich gegenseitig verbessern und unterstützen, weil, gemeinsam sind wir stark auch als Punktmutationen!

Sollte B eingetreten sein kommt man zum Schritt DNAShuffling.

=== Schritt 3: Ich mixe mir mein Gen ===

DNAshuffling simuliert salopp gesagt Sex im Reagenzglas. Das, was beim Sex bei den Chromosomen passiert, das sogenannte crossing-over[vii], welches bedeutet, dass sich die DNA Stränge in Sachen Geninformation mischen und kombinieren. Genaueres kann sich jeder auf der Webseite in der Fußnote durchlesen, das würde jetzt zu weit führen hier noch mal Schulstoff komplett zu wiederholen.

„Simuliert“ wird das im Reagenzglas eher auf die brutale Art und Weise (also mit deutlich weniger Spaß für die Beteiligten als beim natürlichen crossing-over).

1.      Man hackstückelt sein Gen in handliche Fragmente von 50-200 Basenpaaren. Dafür kann man Enzym/Eiweiß namens DNAse verwenden, die DNA wahllos verhackstückelt (schwer zu kontrollieren) oder eine chemische Methode, die ich in meiner Promotion entwickelt haben namens (NExT) DNA shuffling [viii] (ja, schamlose Eigenwerbung. Ich habe die Drecksarbeit an der Bench gemacht, mein Doktorvater hat sich aber den Erstautor genommen und seiner Frau den Letztautor, also die Gruppenleiterposition gegeben. Unschöne Geschichte). Die experimentellen Details kann jeder selbst nachlesen, den es interessiert.

2.      Diese kleinen Fragmente reinigt man mit den üblichen, bekannten Methoden.

3.      Man setzt die Fragmente wieder zusammen, zufällig und zwar mittels Tataaaaaaaaaaaaa PCR. Wer hätte das gedacht? Diese PCR nennt sich total kreativ WiederzusammensetzPCR oder halt auf Englisch Reassembly PCR.

Und jetzt wird es spannend…

Das Schaubild stammt aus einem meiner alten Buchkapitel[1]

Die kleinen DNA Fragmente dienen sich dabei gegenseitig als Primer und verlängern sich spontan gegenseitig wieder zum ganzen Gen (mit einigen Unfällen und Fehlern, aber es kommt einiges an wiederzusammengesetztem korrektem Gen dabei heraus).

Anmerkung: An dieser Stelle kann man z. Bsp. auch zusätzliche Fragmente wie eine Furin-Schnittstelle in die Mischung werfen und schauen, ob und wo sie integriert und trotzdem noch ein funktionsfähiges Protein entsteht.

Irgendwann wird man zum Screenen der Furin Schnittstelle dann schon in Zellkultur und Pseudoviren wechseln müssen, schätze ich. Bei Zellkultur bin ich aber raus, habe ich nie gemacht.

Diese wieder zusammengesetzten Gene kopiert und vermehrt man mittels PCR (schon wieder *gähn*), weil die Menge einfach zu klein ist, um damit gescheit arbeiten zu können und packt die in seinen Phagen der Wahl. Und das Spiel beginnt von vorne.

Ist das System robust und sauber aufgesetzt, schafft man 1-2 Runden Evolution pro Woche.

====Kleiner Coronatest Exkurs====

Warum ist die Fehlerrate bei der Corona PCR möglicherweise so hoch?

1.      Sie verwenden Taq mit Mangan im Puffer (geschenkt).

2.      Es ist eine 2 Stufen PCR. Der abgekratzte RNA Trümmerhaufen aus den geschundenen Nasen wird erst einmal in zufällige DNA-Fragmente übersetzt und anschließen lässt man da Taq und Primer drauf los… Erkennt ihr die Parallelen zum DNA-Shuffling und zur Reassembly PCR?!

Wer mag, darf den Text gerne ins Englische übersetzen, ich bin zu faul dazu.

[1]https://www.researchgate.net/publication/227206563_Directed_Protein_Evolution

[i]https://www.researchgate.net/publication/227206563_Directed_Protein_Evolution

[ii]https://www.gesetze-im-internet.de/wisszeitvg/BJNR050610007.html

[iii] Wilson DS, Keefe AD. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. 2001 May;Chapter 8:Unit8.3. doi: 10.1002/0471142727.mb0803s51. PMID: 18265275.

[iv] https://de.wikipedia.org/wiki/Bakteriophagen

[v] https://de.wikipedia.org/wiki/Phagen-Display

[vi]

http://molecularcloning.com/

[vii] https://www.biologie-seite.de/Biologie/Crossing-over

[viii] Müller KM, Stebel SC, Knall S, Zipf G, Bernauer HS, Arndt KM. Nucleotide exchange and excision technology (NExT) DNA shuffling: a robust method for DNA fragmentation and directed evolution. Nucleic Acids Res. 2005 Aug 1;33(13):e117. doi: 10.1093/nar/gni116. PMID: 16061932; PMCID: PMC1182171.

[i] https://www.projectveritas.com/news/pfizer-executive-mutate-covid-via-directed-evolution-for-company-to-continue/